Name: visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy
Uploaded: 2012-05-01T12:03:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av Max Planck samfunnet.

1. Prøvepreparering <ol class="lalpha"><li> Forbereder dekker slips Dekkglass bør renses fra støvpartikler som TIRF er følsom for bakgrunnen signaler som følger av dekkglass (Fig. 1A, Movie 1). <ol><li> Bruk pinsett Sett dekslet slips i en keramisk holder med lokk. </li><li> Fyll glassbeholder med en M NaOH (kan gjenbrukes flere ganger). </li><li> Inkuber i 2 t etter treg kontinuerlig rotasjon (orbital shaker). Overdreven inkubasjon (&gt; 8 timer) vil skape ugjennomsiktig dekke slips. </li...

<ol>
	<li>Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+inflection+fluorescent+microscopy.">Total internal inflection fluorescent microscopy.</a> J. Microsc. 129, 19-28 (1983).</li><li>Axelrod, D., Omann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+microscopy.">Combinatorial microscopy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Dominguez-Escobar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processive+movement+of+MreB-associated+cell+wall+biosynthetic+complexes+in+bacteria.">Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria.</a> Science. 333, 225-228 (2011).</li><li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+it,+switch+it,+bounce+it,+pull+it:+using+lasers+to+reveal+plant+cell+dynamics.">Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics.</a> J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).</li><li>Uchida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+and+absolute+configuration+of+avenolide,+extracellular+factor+in+Streptomyces+avermitilis.">Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis.</a> J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).</li><li>Yu, H., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actin+dynamics:+Generating+randomness+by+formin(g)+and+moving.">Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving.</a> Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).</li><li>Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actin+dynamics+driven+by+formins+and+myosin+V.">Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V.</a> J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).</li><li>Berchtold, D., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TORC2+plasma+membrane+localization+is+essential+for+cell+viability+and+restricted+to+a+distinct+domain.">TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).</li><li>Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+and+single-molecule+imaging+of+plant+fluorescent+proteins+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).</li></ol>

TIRF mikroskopi er teknikken for valg til bilde perifere proteiner. Den lave inntrengningsdybde av evanescent feltet minimerer ute av fokus lys, noe som fører til en meget god signal til støyforhold og lar datainnsamling med høy bildefrekvens, eller avbildning av meget svakt uttrykte proteiner. Kombinasjonen av høy kontrast og høy bildefrekvens gjør TIRF mikroskopi et perfekt verktøy for bildebehandling spatio-temporale dynamikken i cortically lokaliserte proteiner. Interessant den tykke celleveggen rundt mange m...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på verktøy / reagensen </td><td> Type </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> Tool </td><td> UniEquip </td><td> UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER </td></tr><tr><td> TIRF mikroskop </td><td> Till </td><td></td><td> Tilpasset oppsett </td></tr><tr><td> Glassbeholder </td><td> Tool </td><td> Vitlab </td><td> 340-232880353 </td></tr><tr><td> Keramisk farging stativ </td><td> Tool </td><td> Thomas Sci. </td><td> 8542E40 </td></tr><tr><td> Concanavalin A </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> L7647 </td></tr><tr><td> Dekkglass # 1 (18 x 18 mm) </td><td> Microscope </td><td> Menzel Glaser </td><td> BB018018A1 </td></tr><tr><td> Objektglass </td><td> Microscope </td><td> Menzel Glaser </td><td> AA00000102E </td></tr><tr><td> Neddyppingsolje </td><td> Microscope </td><td> Zeiss </td><td> Immersol 518F </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> FluoSpheres </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> F8795 </td></tr></tbody></table>

visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy

TIRF mikroskopi har dukket opp som en kraftig bildeteknologi for å studere spatio-temporale dynamikken i fluorescerende molekyler in vitro og i levende celler ett. Den optiske fenomenet total intern refleksjon oppstår når lys passerer fra et medium med høy brytningsindeks til et medium med lav brytningsindeks på skrå større enn en karakteristisk kritisk vinkel (dvs. nærmere å bli parallelt med grensen). Selv om alt lyset reflekteres tilbake under slike forhold, er en evanescent bølge opprettet som forplantar seg over og langs grensen, som henfaller eksponentielt med avstanden, og bare trenger eksempler områder som er 100-200 nm nær grensesnittet to. I tillegg til å gi overlegen aksial oppløsning, skaper redusert eksitasjon av ute av fokus fluorophores en meget høy signal til støyforholdet og minimaliserer skadevirkningene av photobleaching 2,3. Å være en widefield teknikk, gjør TIRF også raskere bilde acquisition enn de fleste skanning baserte confocal oppsett. Ved første øyekast ser den lave inntrengningsdybde av TIRF å være uforenlig med avbildning av bakterie-og sopp celler, som ofte er omgitt av tykke cellevegger. Tvert imot har vi funnet at celleveggene i gjær og bakterieceller faktisk forbedre brukbarheten av TIRF og øke omfanget av observerbare strukturer 4-8. Mange cellulære prosesser kan derfor få direkte tilgang ved TIRF i små, encellede mikroorganismer, som ofte tilbyr kraftige genetisk manipulering teknikker. Dette gir oss muligheten til å utføre in vivo biokjemi eksperimenter, der kinetikk protein interaksjoner og aktiviteter kan være direkte vurderes i levende celler. Vi beskriver her de enkelte trinnene som kreves for å oppnå høy kvalitet TIRF bilder for Saccharomyces cerevisiae eller Bacillus subtilis celler. Vi peker ut ulike problemer som kan Affect TIRF visualisering av fluorescerende prober i celler og illustrere prosedyren med flere bruksområder. Til slutt viser vi hvordan TIRF bilder kan bli ytterligere forbedret ved hjelp av etablerte image restaurering teknikker.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Total Internal Reflection Fluorescens (TIRF) mikroskopi er en kraftig tilnærming å observere strukturer nær celleoverflaten ved høy kontrast og tidsmessig oppløsning. Vi viser hvordan TIRF kan brukes til å studere protein dynamikk i cortex av celleveggen lukkede bakterie og sopp celler.

Visualisering av Cortex Organisasjon og Dynamics i Mikroorganismer, bruke Total Internal Reflection fluorescensmikroskopi

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Nanotopology av celleadhesjon på Variable-Angle Total Internal Reflection fluorescensmikroskopi (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høyoppløselig Spatiotemporal Analyse av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescens mikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifisert to-foton Microscope: en søknad til sporing av intracellulær Blemmer

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Fast Fluorescens Imaging til Molecular Diffusion Lov om Aktive cellemembraner i et kommersielt mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Kvantifisere mikroorganismer i lave konsentrasjoner bruker Digital holografiske mikroskopi (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

Pattedyr celledeling i 3D matriser via kvantitative AC Confocal refleksjon mikroskopi

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Gjennomføre flere Imaging modi med en fluorescens mikroskopet

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisere vedheft formasjon i celler ved hjelp av avansert spinner disken totalt interne refleksjon fluorescens mikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisering av Germinosomes og interne membran i Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...