Name: visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy
Uploaded: 2012-05-01T12:03:00
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Este trabalho foi financiado pela Sociedade Max Planck.

1. Preparação da Amostra <ol class="lalpha"><li> Preparando lamínulas Lamelas devem ser limpos a partir de partículas de pó como TIRF é sensível a sinais de fundo resultantes da lamela (Fig. 1A, Filme 1). <ol><li> Usando fórceps lamínulas lugar em um suporte de cerâmica com tampa. </li><li> Encha recipiente de vidro com 1 M NaOH (pode ser reutilizado várias vezes). </li><li> Incubar durante 2 h sob rotação contínua lenta (agitador orbital). Incubação excessiva (&gt; 8 h) criará...

<ol>
	<li>Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+inflection+fluorescent+microscopy.">Total internal inflection fluorescent microscopy.</a> J. Microsc. 129, 19-28 (1983).</li><li>Axelrod, D., Omann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+microscopy.">Combinatorial microscopy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Dominguez-Escobar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processive+movement+of+MreB-associated+cell+wall+biosynthetic+complexes+in+bacteria.">Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria.</a> Science. 333, 225-228 (2011).</li><li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+it,+switch+it,+bounce+it,+pull+it:+using+lasers+to+reveal+plant+cell+dynamics.">Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics.</a> J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).</li><li>Uchida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+and+absolute+configuration+of+avenolide,+extracellular+factor+in+Streptomyces+avermitilis.">Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis.</a> J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).</li><li>Yu, H., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actin+dynamics:+Generating+randomness+by+formin(g)+and+moving.">Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving.</a> Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).</li><li>Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actin+dynamics+driven+by+formins+and+myosin+V.">Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V.</a> J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).</li><li>Berchtold, D., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TORC2+plasma+membrane+localization+is+essential+for+cell+viability+and+restricted+to+a+distinct+domain.">TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).</li><li>Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+and+single-molecule+imaging+of+plant+fluorescent+proteins+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).</li></ol>

Microscopia TIRF é a técnica de escolha para as proteínas de imagem periféricos. A profundidade de penetração de baixo do campo evanescente minimiza de fora do foco de luz, o que leva a um sinal muito bom para relação de ruído e permite que a aquisição de dados com altas taxas de quadros de imagem, ou de proteínas muito fracamente expressas. A combinação de alto contraste e altas taxas de quadros faz TIRF microscopia uma ferramenta perfeita para imagens espaço-temporais dinâmica de proteínas corticalmen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome da ferramenta / reagente </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> Ferramenta </td><td> UniEquip </td><td> UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER </td></tr><tr><td> Microscópio TIRF </td><td> Até </td><td></td><td> Configuração personalizada </td></tr><tr><td> Recipiente de vidro </td><td> Ferramenta </td><td> VITLAB </td><td> 340-232880353 </td></tr><tr><td> Suporte de coloração Cerâmica </td><td> Ferramenta </td><td> Thomas Sci. </td><td> 8542E40 </td></tr><tr><td> Concanavalina A </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> L7647 </td></tr><tr><td> Lamelas # 1 (18 x 18 mm) </td><td> Microscópio </td><td> Menzel Glaser </td><td> BB018018A1 </td></tr><tr><td> Lâminas de Microscopia </td><td> Microscópio </td><td> Menzel Glaser </td><td> AA00000102E </td></tr><tr><td> Óleo de imersão </td><td> Microscópio </td><td> Zeiss </td><td> Immersol 518F </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> FluoSpheres </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> F8795 </td></tr></tbody></table>

visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy

Microscopia TIRF emergiu como uma tecnologia de imagem poderosa para estudar espácio-temporais dinâmica de moléculas fluorescentes in vitro e em células vivas 1. O fenómeno óptico de reflexão interna total ocorre quando a luz passa de um meio com elevado índice de refracção em um meio com baixo índice de refracção com um ângulo maior do que um ângulo característica crítica (isto é, mais perto de ser paralelo com o limite). Embora toda a luz é reflectida de volta sob tais condições, uma onda evanescente é criado que se propaga através e ao longo do limite, que decai exponencialmente com a distância, e só penetra áreas de amostra que são 100-200 nm perto da interface 2. Além de proporcionar resolução axial superior, a excitação reduzida de fora do foco fluoróforos cria um sinal muito alta para relações de ruído e minimiza os efeitos prejudiciais da fotodegradação 2,3. Sendo uma técnica de campo amplo, TIRF também permite que imagem mais rápido acquisition do que a maioria de digitalização baseados em configurações confocal. À primeira vista, a profundidade de penetração baixa de TIRF parece ser incompatível com a imagem de células bacterianas e fúngicas, que são muitas vezes cercados por paredes celulares espessas. Pelo contrário, verificou-se que as paredes celulares de levedura e células bacterianas realmente melhorar a usabilidade do TIRF e aumentar a gama de estruturas observáveis ​​4-8. Muitos processos celulares podem ser acessados ​​diretamente pelo TIRF em pequenos microorganismos unicelulares, que muitas vezes oferecem poderosas técnicas de manipulação genética. Isso nos permite executar em experimentos de bioquímica in vivo, onde cinética de interações protéicas e atividades podem ser avaliados diretamente em células vivas. Descrevemos aqui os passos individuais necessárias para obter imagens de alta qualidade para TIRF Saccharomyces cerevisiae ou células de Bacillus subtilis. Ressalte-se vários problemas que podem Affect visualização TIRF de sondas fluorescentes em células e ilustram o procedimento com vários exemplos de aplicação. Por fim, demonstramos como as imagens TIRF pode ser melhorada usando técnicas de restauração de imagem estabelecidos.

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Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Total reflexão interna de fluorescência microscopia (TIRF) é uma abordagem poderosa para observar as estruturas perto da superfície da célula em alto contraste e resolução temporal. Demonstramos como TIRF pode ser empregue para estudar a dinâmica de proteína no córtex de parede celular fechados células bacterianas e fúngicas.

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Bioengenharia

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Nanotopology de adesão celular em cima de ângulo variável Microscopia de Fluorescência reflexão interna total (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Quantificação de microrganismos em baixas concentrações, utilizando microscopia holográfica Digital (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

Divisão celular dos mamíferos em matrizes 3D através de microscopia de reflexão Confocal quantitativa

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Realização de vários modos de imagem com um microscópio de fluorescência

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualização do Germinosomes e a membrana interna em esporos de Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...