Name: visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy
Uploaded: 2012-05-01T12:03:00
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Este trabajo fue financiado por la Sociedad Max Planck.

1. Preparación de la muestra <ol class="lalpha"><li> Preparación de la cubierta se desliza Los cubreobjetos se debe limpiar de partículas de polvo como TIRF es sensible a señales de fondo derivados de la cubreobjetos (Fig. 1A, Película 1). <ol><li> El uso de pinzas cubreobjetos lugar en un soporte de cerámica con tapa. </li><li> Llenar recipiente de vidrio con NaOH 1 M (se puede reutilizarse múltiples veces). </li><li> Se incuba durante 2 horas con rotación lenta continua (agitador). El...

<ol>
	<li>Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+inflection+fluorescent+microscopy.">Total internal inflection fluorescent microscopy.</a> J. Microsc. 129, 19-28 (1983).</li><li>Axelrod, D., Omann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+microscopy.">Combinatorial microscopy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Dominguez-Escobar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processive+movement+of+MreB-associated+cell+wall+biosynthetic+complexes+in+bacteria.">Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria.</a> Science. 333, 225-228 (2011).</li><li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+it,+switch+it,+bounce+it,+pull+it:+using+lasers+to+reveal+plant+cell+dynamics.">Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics.</a> J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).</li><li>Uchida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+and+absolute+configuration+of+avenolide,+extracellular+factor+in+Streptomyces+avermitilis.">Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis.</a> J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).</li><li>Yu, H., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actin+dynamics:+Generating+randomness+by+formin(g)+and+moving.">Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving.</a> Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).</li><li>Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actin+dynamics+driven+by+formins+and+myosin+V.">Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V.</a> J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).</li><li>Berchtold, D., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TORC2+plasma+membrane+localization+is+essential+for+cell+viability+and+restricted+to+a+distinct+domain.">TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).</li><li>Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+and+single-molecule+imaging+of+plant+fluorescent+proteins+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).</li></ol>

Microscopía TIRF es la técnica de elección para las proteínas de la imagen periféricos. La profundidad de penetración baja del campo evanescente minimiza de fuera de foco de luz, lo que conduce a una señal de muy buena a ruido y permite la adquisición de datos con altas velocidades de fotogramas o imágenes de las proteínas expresadas muy débilmente. La combinación de alto contraste y alta velocidad de fotogramas hace de la microscopía TIRF una herramienta perfecta para imagen dinámica espacio-temporal de l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de la herramienta / reactivo </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Agitador orbital </td><td> Herramienta </td><td> UniEquip </td><td> UNITWIST en 3-D DIRECCIÓN SHAKER </td></tr><tr><td> TIRF microscopio </td><td> Hasta </td><td></td><td> Configuración personalizada </td></tr><tr><td> De envases de vidrio </td><td> Herramienta </td><td> Vitlab </td><td> 340-232880353 </td></tr><tr><td> Rejilla de coloración de cerámica </td><td> Herramienta </td><td> Thomas Ciencia. </td><td> 8542E40 </td></tr><tr><td> Concanavalina A </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> L7647 </td></tr><tr><td> Cubreobjetos # 1 (18 x 18 mm) </td><td> Microscopio </td><td> Menzel Gläser </td><td> BB018018A1 </td></tr><tr><td> Preparaciones para microscopio </td><td> Microscopio </td><td> Menzel Gláser </td><td> AA00000102E </td></tr><tr><td> Inmersión en aceite </td><td> Microscopio </td><td> Zeiss </td><td> Immersol 518F </td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> FluoSpheres </td><td> Reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> F8795 </td></tr></tbody></table>

visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy

Microscopía TIRF se ha convertido en una tecnología de imagen de gran alcance para estudiar dinámica espacio-temporal de las moléculas fluorescentes in vitro y en células vivas 1. El fenómeno óptico de reflexión interna total ocurre cuando la luz pasa de un medio con alto índice de refracción en un medio con bajo índice de refracción en un ángulo mayor que un ángulo característica crítica (es decir, más cerca de ser paralelo con el límite). Aunque toda la luz se refleja de nuevo bajo tales condiciones, una onda evanescente se crea que se propaga a través ya lo largo del límite, que decae exponencialmente con la distancia, y sólo penetra áreas de la muestra que son 100-200 nm cerca de la interfaz 2. Además de proporcionar resolución axial superior, la excitación reducida de fuera de fluoróforos focales crea una señal de muy alta a ruido y minimiza los efectos perjudiciales de photobleaching 2,3. Al ser una técnica de campo amplio, TIRF también permite que la imagen más rápido de corriente alternaquisition que la mayoría de exploración basados ​​en configuraciones confocal. A primera vista, la profundidad de penetración bajo TIRF parece ser incompatible con la imagen de las células bacterianas y de hongos, que a menudo rodeadas de paredes celulares gruesas. Por el contrario, hemos encontrado que las paredes celulares de levadura y células bacterianas en realidad mejorar la facilidad de uso de TIRF y aumentar la gama de estructuras observables 4-8. Muchos procesos celulares por lo tanto, se puede acceder directamente por la TIRF en pequeños microorganismos unicelulares, que a menudo ofrecen poderosas técnicas de manipulación genética. Esto nos permite llevar a cabo en los experimentos de bioquímica in vivo, donde la cinética de las interacciones de las proteínas y las actividades se puede evaluar directamente en las células vivas. Se describe aquí los pasos individuales necesarios para obtener imágenes de alta calidad para TIRF Saccharomyces cerevisiae o células de Bacillus subtilis. Se señala varios problemas que pueden Affect TIRF visualización de sondas fluorescentes en las células e ilustrar el procedimiento con varios ejemplos de aplicación. Por último, se demuestra cómo las imágenes TIRF se puede mejorar usando técnicas de restauración de imagen establecidos.

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Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) microscopía es un enfoque poderoso para observar las estructuras cerca de la superficie celular en alto contraste y resolución temporal. Se demuestra cómo TIRF puede ser empleado para estudiar la dinámica de proteínas en la corteza de la pared celular-cerrados células bacterianas y fúngicas.

La visualización de la corteza organización y dinámica de los microorganismos, con total Microscopía de fluorescencia de reflexión interna

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Investigación

Bioingeniería

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Nanotopology de adhesión celular en ángulo variable total microscopía de fluorescencia de reflexión interna (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Cuantificación de microorganismos a bajas concentraciones usando microscopia holográfica Digital (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

División de célula mamífera en Matrices 3D mediante microscopia de reflexión Confocal cuantitativa

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualización de Germinosomes y la membrana interna de las esporas de Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...