Name: visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy
Uploaded: 2012-05-01T12:03:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av Max Planck-sällskapet.

1. Provberedning <ol class="lalpha"><li> Förbereda täckglas Täckglas bör rengöras från damm partiklar som TIRF är känslig för bakgrunden signaler som härrör från täckglaset (Fig. 1A, Film 1). <ol><li> Använd pincett glider plats omslag i ett keramiskt hållare med lock. </li><li> Fylla glasbehållare med 1 M NaOH (kan återanvändas flera gånger). </li><li> Inkubera under 2 h under långsam kontinuerlig rotation (orbital shaker). Överdriven inkubering (&gt; 8 timmar) kommer att ...

<ol>
	<li>Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+inflection+fluorescent+microscopy.">Total internal inflection fluorescent microscopy.</a> J. Microsc. 129, 19-28 (1983).</li><li>Axelrod, D., Omann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+microscopy.">Combinatorial microscopy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Dominguez-Escobar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processive+movement+of+MreB-associated+cell+wall+biosynthetic+complexes+in+bacteria.">Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria.</a> Science. 333, 225-228 (2011).</li><li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+it,+switch+it,+bounce+it,+pull+it:+using+lasers+to+reveal+plant+cell+dynamics.">Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics.</a> J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).</li><li>Uchida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+and+absolute+configuration+of+avenolide,+extracellular+factor+in+Streptomyces+avermitilis.">Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis.</a> J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).</li><li>Yu, H., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actin+dynamics:+Generating+randomness+by+formin(g)+and+moving.">Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving.</a> Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).</li><li>Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+actin+dynamics+driven+by+formins+and+myosin+V.">Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V.</a> J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).</li><li>Berchtold, D., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TORC2+plasma+membrane+localization+is+essential+for+cell+viability+and+restricted+to+a+distinct+domain.">TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).</li><li>Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+and+single-molecule+imaging+of+plant+fluorescent+proteins+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).</li></ol>

TIRF mikroskopi är den teknik som väljs för att bilden perifera proteiner. Den låga penetrationen djup försvinnande området minimerar för oskarp ljus, vilket leder till en mycket bra signal-brus-förhållande och tillåter datainsamling med hög bildfrekvens, eller avbildning av mycket svagt uttryckta proteiner. Kombinationen av hög kontrast och hög chassi gör TIRF mikroskopi ett perfekt verktyg för avbildning spatio-temporala dynamiken i cortically lokaliserade proteiner. Intressant den tjocka cellväggen so...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på verktyget / reagens </td><td> Typ </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Orbitalskakare </td><td> Verktyget </td><td> UniEquip </td><td> UNITWIST 3-D-navigeringsknappen SHAKER </td></tr><tr><td> TIRF mikroskop </td><td> To </td><td></td><td> Anpassad installation </td></tr><tr><td> Glasbehållaren </td><td> Verktyget </td><td> Vitlab </td><td> 340-232.880.353 </td></tr><tr><td> Keramiska färgning kuggstång </td><td> Verktyget </td><td> Thomas Sci. </td><td> 8542E40 </td></tr><tr><td> Konkanavalin A </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> L7647 </td></tr><tr><td> Täckglas # 1 (18 x 18 mm) </td><td> Mikroskop </td><td> Menzel Glaser </td><td> BB018018A1 </td></tr><tr><td> Objektglas </td><td> Mikroskop </td><td> Menzel GLäser </td><td> AA00000102E </td></tr><tr><td> Immersionsolja </td><td> Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Immersol 518F </td></tr><tr><td> Agaros </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> FluoSpheres </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> F8795 </td></tr></tbody></table>

visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy

TIRF mikroskopi har blivit en kraftfull bildteknik för att studera spatio-temporala dynamiken i fluorescerande molekyler i in vitro och i levande celler 1. Det optiska fenomenet av total intern reflektion inträffar när ljus passerar från ett medium med högt brytningsindex i ett medium med lågt brytningsindex vid en vinkel större än en karakteristisk kritisk vinkel (dvs närmare att vara parallell med gränsen). Även om allt ljus reflekteras tillbaka under sådana förhållanden, är en försvinnande våg skapas som utbreder sig över och längs gränsen, som sönderfaller exponentiellt med avståndet, och endast tränger prov områden som är 100-200 nm nära gränssnittet 2. Förutom att tillhandahålla överlägsna axiell upplösning, ger den minskade excitering av oskarpa fluoroforer ett mycket högt signal-till-brusförhållanden och minimerar skadliga effekterna av fotoblekning 2,3. Att vara en widefield teknik gör TIRF också snabbare bilden ACFörvärvet än de flesta skanning baserade konfokala inställningar. Vid första anblicken verkar låg penetration djup TIRF är oförenligt med avbildning av bakterie-och svamp celler, som ofta omges av tjocka cellväggar. Tvärtom, har vi funnit att cellväggarna av jäst och bakterieceller faktiskt förbättrar användbarheten av TIRF och öka utbudet av observerbara strukturer 4-8. Många cellulära processer kan därför direkt åtkomst till TIRF i små, encelliga mikroorganismer, som ofta erbjuder kraftfulla genetiska manipulation tekniker. Detta tillåter oss att genomföra in vivo biokemi experiment, där kinetiken av protein interaktioner och aktiviteter direkt kan bedömas i levande celler. Vi beskriver här de olika steg som krävs för att få bilder med hög kvalitet TIRF för Saccharomyces cerevisiae eller Bacillus subtilis celler. Vi påpeka olika problem som kan Affect TIRF visualisering av fluorescerande prober i celler och illustrera proceduren med flera applikationsexempel. Slutligen visar vi hur TIRF bilder ytterligare kan förbättras med hjälp av etablerade tekniker bild restaurering.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Fluorescens vid total internreflexion (TIRF) mikroskopi är en kraftfull metod för att observera strukturer nära cellens yta vid hög kontrast och temporal upplösning. Vi visa hur TIRF kan användas för att studera protein-dynamiken vid cortex av cellväggen slutna bakterie-och svampceller.

Visualisering av Cortex Organisation och Dynamics i mikroorganismer, med total inre Mikroskopi fluorescens

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisering av Rekombinant DNA och proteinkomplex Använda atomkraftsmikroskopi

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Nanotopology av celladhesion vid rörlig Vinkel total inre reflektion fluorescensmikroskopi (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Högupplöst Spatiotemporal Analys av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescensmikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifierad Två-foton Mikroskop: En ansökan till spårning av intracellulära vesiklar

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Från Snabb fluorescens avbildning till molekylär diffusion lagen om Live cellmembran i en kommersiell mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Kvantifiera mikroorganismer vid låga koncentrationer använder digitala holografisk mikroskopi (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

Däggdjur celldelning i 3D matriser via kvantitativa Confocal speglar mikroskopi

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Genomföra flera Imaging lägen med en fluorescens Mikroskop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisera vidhäftning bildandet i celler med hjälp av avancerade Spinning Disk-totalt inre reflektion fluorescensmikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Visualisering av Germinosomes och det inre membranet i Bacillus subtilis sporer

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...