Name: directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards t lymphocytes
Uploaded: 2012-05-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes at JoVE.com

Vi tackar Dr Shinya Yamanaka (Kyoto University) för att ge IPS-MEF-ng-20D-17 cellinje, Dr Dario Vignali (St Jude Barnens Research Hospital) för att stödja OT1-2A • pMig II konstruktion, Dr Juan carlos Zuniga-Pflucker (Institutionen för immunologi, University of Toronto) för att stödja OP9-DL1 cellinje, och Dr Kent E Vrana (Institutionen för farmakologi, Penn State University College of Medicine) för att hjälpa utformningen av denna studie. Detta projekt finansieras under bidrag med licensnummer K18CA151798 från National Cancer Institute, Barsumian Trust och melanom Research Foundation (J. Song).

1. Cellodling <ol><li> Beredning av bestrålade SNL76 / 7 (irSNL76 / 7) matarceller för kultur. SNL76 / 7 celler bibehålls generellt i 10% fetalt bovint serum (FBS) Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) medium. <ol><li> En odlingsskål eller kolv skall beläggas med 0,1% gelatinlösning i 37 ° C, inkubator under 30 minuter innan den återhämtar SNL76 / 7 celler från flytande kväve. </li><li> När SNL76 / 7 cellerna når sammanflytning, kommer celler trypsiniserades bort, centrifugerades vid 400 g under 5...

<ol>
	<li>Brenner, M. K., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T+cell+therapy+of+cancer.">Adoptive T cell therapy of cancer.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).</li><li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+memory+CD4++T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance.">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li><li>Seki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7/STAT5+cytokine+signaling+pathway+is+essential+but+insufficient+for+maintenance+of+naive+CD4+T+cell+survival+in+peripheral+lymphoid+organs.">IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs.</a> J. Immunol. 178, 262-270 (2007).</li><li>Stemberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+naive+CD8++T+cell+precursor+can+develop+into+diverse+effector+and+memory+subsets.">A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets.</a> Immunity. 27, 985-997 (2007).</li><li>Siewert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-driven+development:+effector/memory-like+alphaE+Foxp3++regulatory+T+cells+originate+from+both+naive+T+cells+and+naturally+occurring+naive-like+regulatory+T+cells.">Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells.</a> J. Immunol. 180, 146-155 (2008).</li><li>Wang, L. X., Plautz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-primed,+in+vitro-activated+CD4++effector+T+cells+establish+long-term+memory+without+exogenous+cytokine+support+or+ongoing+antigen+exposure.">Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure.</a> J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).</li><li>Hinrichs, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+effector+CD8++T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy.">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117, 808-814 (2011).</li><li>Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+a+tumor-specific,+MHC-unrestricted+T-cell+receptor+expressed+on+effector+cells+of+the+innate+and+the+adaptive+immune+system+through+bone+marrow+transduction+and+immune+reconstitution.">Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution.</a> Blood. 105, 4583-4589 (2005).</li><li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells.">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).</li><li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+generation+of+tumor-specific+T+cells+from+genetically+engineered+human+hematopoietic+stem+cells+via+Notch+signaling.">Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling.</a> Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).</li><li>Boztug, K., Med, N. .. E. n. g. l. .. J. .. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell+gene+therapy+for+the+Wiskott-Aldrich+syndrome.">Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1918-1927 (2010).</li><li>Peerani, R., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+stem+cell+therapies+through+synthetic+stem+cell-niche+engineering.">Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering.</a> J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).</li><li>Mendez-Ferrer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche.">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466, 829-834 (2010).</li><li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+generation+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells+for+combined+gene+and+cell+therapy+of+hematologic+disorders.">Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders.</a> Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).</li><li>Boitano, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329, 1345-1348 (2010).</li><li>Himburg, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells.">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat. Med. 16, 475-482 (2010).</li><li>Tanigaki, K., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lymphocyte+development+by+Notch+signaling.">Regulation of lymphocyte development by Notch signaling.</a> Nature immunology. 8, 451-456 (2007).</li><li>Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474, 212-215 (2011).</li></ol>

<html> För ACT-baserade terapier, är in vitro-generering av ett stort antal starkt reaktiva Ag-specifika T-celler för in vivo-återinfusion en optimal strategi. Även om vår in vitro-metod ger upphov av funktionella T-celler från iPS-celler, ett stort antal iPS cell-härledda celler dör i fyra veckor, särskilt i den fjärde veckan. Vi drar slutsatsen att överlevnad signalerna från Notch signalering medieras av DL1 liksom IL-7 och Flt3L är inte tillräcklig för att upprätthålla öve...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> C57BL/6J-möss </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 000.664 </td></tr><tr><td> B6.129S7-Rag1 tm1Mom / J </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 002.216 </td></tr><tr><td> Anti-CD3 (2C11) antikropp </td><td> BD PharMingen </td><td> 553.058 </td></tr><tr><td> Anti-CD28 (37,51) antikropp </td><td> BD PharMingen </td><td> 553.295 </td></tr><tr><td> Anti-CD3 (17A2) antikropp </td><td> BioLegend </td><td> 100.202 </td></tr><tr><td> Anti-CD4 (GK1.5) antikropp </td><td> BioLegend </td><td> 100.417 </td></tr><tr><td> Anti-CD8 (53-6,7) antikropp </td><td> BioLegend </td><td> 100.714 </td></tr><tr><td> Anti-CD25 (3C7) antikropp </td><td> BioLegend </td><td> 101.912 </td></tr><tr><td> Enti-CD44 (1M7) antikropp </td><td> BioLegend </td><td> 103.012 </td></tr><tr><td> Anti-CD117 (2B8) antikropp </td><td> BioLegend </td><td> 105.812 </td></tr><tr><td> Anti-TCR-β (H57597) antikropp </td><td> BioLegend </td><td> 109.220 </td></tr><tr><td> Anti-IL-2 (JES6-5H4) antikropp </td><td> BioLegend </td><td> 503.810 </td></tr><tr><td> Anti-IFN-γ (XMG1.2) antikropp </td><td> BioLegend </td><td> 505.822 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> α-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> A10490-01 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3007.01 </td></tr><tr><td> Brefeldin A </td><td> Sigma </td><td> B7651 </td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> 107.689 </td></tr><tr><td> GeneJammer </td><td> Integrerad Sciences </td><td> 204.130 </td></tr><tr><td> RNA-kit &lt;/ Td&gt; <td> Qiagen </td><td> 74.104 </td></tr><tr><td> DNA-kit </td><td> Qiagen </td><td> 69.504 </td></tr><tr><td> CD8 Isolation Kit </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-095-236 </td></tr><tr><td> ACK lysbuffert </td><td> Lonza </td><td> 10-548E </td></tr><tr><td> mFlt-3L </td><td> PeproTech </td><td> 250-31L </td></tr><tr><td> mIL-7 </td><td> PeproTech </td><td> 217-17 </td></tr><tr><td> Gelatin </td><td> Sigma </td><td> G9391 </td></tr><tr><td> FITC-anti-OVA-antikropp </td><td> Rockland Immunochemicals </td><td> 200-4233 </td></tr><tr><td> Permeabilisering buffert </td><td> Biolegend </td><td> 421.002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A7906 </td></tr><tr><td> Formaldehyd </td><td> Sigma </td><td> F8775 </td></tr><tr><td> 0,4 pm filter </td><td> Millipore </td><td></td></tr><tr><td&gt; Moflo Cell Sorter </td><td> Dake Cytomation </td><td></td></tr><tr><td> Calibur flödescytometer </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> LSR II flödescytometer </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> Mus fixeringsutrustning </td><td> Braintree Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards t lymphocytes

Adoptiv cellöverföring (ACT) av antigen-specifika CD8 + cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) är en lovande behandling för en mängd olika maligniteter 1. CTL kan känna igen maligna celler genom att interagera tumörantigener med de T-cellreceptorer (TCR), och cytotoxiner frisättning samt cytokiner för att döda maligna celler. Det är känt att mindre differentierade och centralt-minne-liknande (benämnda högreaktiva) CTL är den optimala populationen för ACT-baserade immunterapi, eftersom dessa CTL har en hög proliferativ potential, är mindre benägna att apoptos än mer differentierade celler och har en högre förmåga att svara på homeostatiska cytokiner 2-7. På grund av svårigheter att erhålla ett stort antal sådana CTL från patienter, finns det ett akut behov av att hitta en ny strategi för att generera mycket reaktiva Ag-specifika CTL för framgångsrika ACT-baserade behandlingar. TCR transduktion av själv-förnybara stamceller för immunrekonstituering har en terapeutisk potential för behandling av sjukdomar 8-10. Emellertid är metoden för att erhålla embryonala stamceller (ESC) från patienter inte genomförbart. Även om användningen av hematopoietiska stamceller (HSCs) för terapeutiska ändamål har i stor utsträckning i klinik 11-13, har minskat HSCs differentiering och proliferativa kapacitet, och HSCs är svåra att expandera i cellodling in vitro 14-16. Nya iPS cell teknik och utveckling av ett in vitro-system för gentillförsel kan generera iPS-celler från patienter utan kirurgisk metod. Dessutom, liksom ekonomiska och sociala råd, iPS-celler har obestämd proliferativ kapacitet in vitro och har visats differentiera till hematopoietiska celler. Således iPS-celler har större potential att användas i ACT-baserade immunterapi jämfört med ekonomiska och sociala råd eller HSCs. Här presenterar vi metoder för generering av T-lymfocyter från iPS-celler in vitro och in vivo-programmering av antigenspecifika CTL från iPS-celler för att främja cancer immun övervakning. Stimulering in vitro med en Notch-ligand driver T-cell differentiering från iPS-celler, och TCR-genen resulterar i transduktion iPS-celler differentiera till antigen-specifika T-celler in vivo, vilket förhindrar tumörtillväxt. Sålunda, visar vi antigenspecifik differentiering T-cell från iPS-celler. Våra studier ger en potentiellt mer effektiv metod för att generera antigenspecifika CTL för ACT-baserade behandlingar och underlätta utvecklingen av terapeutiska strategier för sjukdomar.

Watch this Scientific Journal Video about Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes at JoVE.com

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Generering av T-lymfocyter från inducerade (IPS) pluripotenta stamceller ger ett alternativt tillvägagångssätt att använda embryonala stamceller för T-cell-baserad immunterapi. Metoden visar att genom användning av antingen<em&gt; In vitro</em&gt; Eller<em&gt; In vivo</em&gt; Insugningssystem, iPS-celler kan differentiera i både konventionella och antigen-specifika T-lymfocyter.

Riktad Differentiering av inducerade pluripotenta stamceller mot T-lymfocyter

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Metoder för att bedöma Beta Medierad Celldöd genom Cytotoxiska T-lymfocyter

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Expanderande Cytotoxiska T-lymfocyter från navelsträngsblod att Target cytomegalovirus, Epstein-Barr-virus, och adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generering av Inducerade regulatoriska T-celler från primära humana naiva och minne T-celler

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Adenoviral Transduktion av naiva CD4 T-celler för att studera Treg Differentiering

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolering och Th17 differentiering för naiv CD4 T-lymfocyter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Härledning av T-celler<em&gt; In Vitro</em&gt; Från Mouse embryonala stamceller

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

In vitro-differentiering av humana CD4 + Foxp3 + Induced regulatoriska T-celler (iTregs) från naiva CD4 + -T-celler med ett TGF-β-innehållande protokoll

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Snabb kvantifiering av Mitogen-inducerad blastogenes i T-lymfocyter för att identifiera immunmodulerande läkemedel

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

En In Vivo musmodell åtgärd naiva CD4 T-cellsaktivering, spridning och Th1 differentiering induceras av benmärgen-derived dendritiska celler

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Inducerad differentiering av M-Cellliknande celler i humana stamcells-härledda ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...