Name: oct4gip reporter assay to study genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00
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私たちは、原稿を読んで、編集するためのブラッドLackfordに感謝します。この研究は国立環境健康科学研究所、保健学内研究プログラム国立研究所Z01ES102745（GHまで）によってサポートされていました。

1。 Oct4GiPマウスES細胞の維持 Oct4GiP細胞は、親切に博士はオースティンスミスによって提供されました。彼らは、Oct4の-GFPiresPacトランス4,5を運ぶ129/Olaマウスから得られた。彼らはESGRO完全プラスクローングレード培地（ミリポア社製）、またはM15培地でゼラチンコート組織培養プレートに保持されます：DMEM（Invitrogen社）は、15％FBS、1000 U / mlのESGRO（ミリポア社製?...

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	<li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+differentiation:+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine.">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations:+lessons+from+embryonic+development.">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li><li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal.">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li><li>Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+potency+by+spontaneous+fusion.">Changing potency by spontaneous fusion.</a> Nature. 416, 545-548 (2002).</li><li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation.">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li><li>Nichols, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+pluripotent+stem+cells+in+the+mammalian+embryo+depends+on+the+POU+transcription+factor+Oct4.">Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.</a> Cell. 95, 379-391 (1998).</li><li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+expression+of+Oct-3/4+defines+differentiation,+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells.">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li><li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity.">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li><li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+cloning+of+Nanog,+a+pluripotency+sustaining+factor+in+embryonic+stem+cells.">Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells.</a> Cell. 113, 643-655 (2003).</li><li>Masui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+governed+by+Sox2+via+regulation+of+Oct3/4+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).</li><li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells.">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li><li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity.">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li><li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+embryonic+stem+(ES)+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor.">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li><li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+embryonic+stem+cell+state.">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li><li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution.">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li><li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2.">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li><li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells.">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li><li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture.">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li></ol>

我々は上記の記述Oct4GiPレポーターアッセイは、定量的に自己再生対分化の程度を測定することができます。そのような形態をベース12と増殖/生存性アッセイなど他の利用可能な方法に比べ、より高い感度とスループットだけでなく、ES細胞の状態のより直接的な測定を提供しています。したがって、大規模な画面や遺伝的エピスタシス解析のために適している。実際、我々と他の成?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> ESGRO完全プラスクローングレード媒体</td><td>ミリポア</td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM（高グルコース1X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11965 </td></tr><tr><td> 0.25％トリプシン-EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> 25200 </td></tr><tr><td>リポフェクタミン2000 </td><td>インビトロジェン</td><td> 1001817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM（血清培地を減らす） </td><td>インビトロジェン</td><td> 31985 </td></tr><tr><td> ESGRO mLIF（10 7 units/1ml） </td><td>ミリポア</td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA（非必須アミノ酸） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11140 </td></tr><tr><td> ES細胞のために100倍ヌクレオシド</td><td>ミリポア</td><td> 10620から1 </td&gt; </tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td>シグマ</td><td> M7522-100ミリリットル</td></tr><tr><td> ES-修飾されたウシ胎児血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 10437 </td></tr><tr><td> NanogのsiRNAを</td><td>インビトロジェン</td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4のsiRNAを</td><td> Dharmacon </td><td> D-046256から02 </td></tr><tr><td> Sox2のsiRNAを</td><td> Dharmacon </td><td> M-058489から01 </td></tr></tbody></table>コントロールsiRNA：Dharamconによって合成されたホタルルシフェラーゼ（5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA）を標的とするsiRNAの二重。

oct4gip reporter assay to study genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal

多能性と自己複製は、胚性幹細胞（ES細胞）の2つの定義特性です。基本的な分子機構を理解することは非常に発生生物学研究、疾患モデル、創薬、再生医療（1,2日で）のES細胞の使用を容易にします。 ES細胞の維持と自己複製の新たな調節因子の同定と特徴付けを促進するために、我々は定量的にOct4GiPセル3を用いたマウスES細胞における自己複製の状態を測定する蛍光レポーターベースのアッセイを開発しました。 Oct4GiP細胞は4,5 Oct4の遺伝子のプロモーター領域の制御下にある緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する。 Oct4のは、ES細胞の自己複製に必要とされており、非常にES細胞で発現し、急速に分化6,7の間にダウンレギュレートされています。その結果、レポーター細胞におけるGFPの発現と蛍光が忠実に相関ES細胞のアイデンティティー5と、蛍光活性化セルソーティング（FACS）で分析が密接に単一細胞レベル3,8の細胞の自己複製状態を監視するために使用することができます。 RNAiのと相まって、Oct4GiPレポーターアッセイは、すぐにES細胞の維持と自己複製3,8のレギュレータを識別し、研究するために使用することができます。自己複製を分析するための他の方法に比べ、それ以上の、便利な高感度、定量的、かつ低コストである。それは、96に実施することができる - または、ハイスループットスクリーニングや遺伝子のエピスタシス解析などの大規模研究のための384ウェルプレート。最後に、他の系統特異的レポーターES細胞株を使用することによって、我々はここで説明するアッセイはまた、ES細胞の分化の間に運命の仕様を勉強するように変更することができます。

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Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

我々はすぐに識別し、マウス胚性幹細胞の維持と自己複製を制御する遺伝子を特徴付けるための蛍光レポーターアッセイを説明します。

マウス胚性幹細胞の維持と自己複製を制御する遺伝子を研究するためにOct4GiPレポーターアッセイ

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

免疫手術でヒト胚性幹細胞の導出

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

in vitroおよびヒト胚性幹細胞のin vivoでの生物発光レポーター遺伝子イメージングの

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

ヒト胚性幹細胞の文化とメンテナンス

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

LIFの不在下で自己再生MESCをサポートするためのSC1（Pluripotin）の使用

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Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

マウスES胚細胞の単離と導出

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Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

テラトーマ形成により、ヒト胚性幹細胞の運命のマッピング

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Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

胚肢の皮膚の血管系のためのホールマウント免疫組織化学的解析：胚における血管分岐形態形成を研究するモデルシステム

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...