Name: oct4gip reporter assay to study genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal at JoVE.com

Мы благодарим Брэд Lackford для чтения и редактирования рукописей. Это исследование было поддержано Национальным институтом экологических наук, Национальный институт здоровья Внутренние Программы исследований Z01ES102745 (на GH).

1. Oct4GiP мыши ES сотового обслуживания Oct4GiP клетки были любезно предоставлены д-р Остин Смит. Они были получены от мышей 129/Ola проведение Oct4-GFPiresPac трансгенов 4,5. Они ведутся в желатин покрытием пластин культуры тканей в ESGRO полный плюс клонального класса средней (Millipore), ил...

<ol>
	<li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+differentiation:+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine.">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations:+lessons+from+embryonic+development.">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li><li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal.">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li><li>Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+potency+by+spontaneous+fusion.">Changing potency by spontaneous fusion.</a> Nature. 416, 545-548 (2002).</li><li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation.">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li><li>Nichols, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+pluripotent+stem+cells+in+the+mammalian+embryo+depends+on+the+POU+transcription+factor+Oct4.">Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.</a> Cell. 95, 379-391 (1998).</li><li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+expression+of+Oct-3/4+defines+differentiation,+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells.">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li><li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity.">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li><li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+cloning+of+Nanog,+a+pluripotency+sustaining+factor+in+embryonic+stem+cells.">Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells.</a> Cell. 113, 643-655 (2003).</li><li>Masui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+governed+by+Sox2+via+regulation+of+Oct3/4+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).</li><li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells.">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li><li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity.">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li><li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+embryonic+stem+(ES)+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor.">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li><li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+embryonic+stem+cell+state.">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li><li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution.">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li><li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2.">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li><li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells.">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li><li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture.">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li></ol>

Анализ Oct4GiP репортер мы описываем выше, можно количественно измерить степень самообновления против дифференциации. По сравнению с другими доступными методами, такими как морфологии на основе 12 и распространения / жизнеспособность на основе анализов, она предлагает высокую чувс?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> ESGRO полный плюс клонального класса средней </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (высокая глюкоза 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> 0,25% Трипсин-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200 </td></tr><tr><td> Липофектамина 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1001817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (снижение сывороточного среды) </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> ESGRO mLIF (10 7 units/1ml) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA (без незаменимых аминокислот) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> 100x Нуклеозиды для ES клетки </td><td> Millipore </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> 2-меркаптоэтанол </td><td> Сигма </td><td> M7522-100мл </td></tr><tr><td> ES-квалифицированных эмбриональной телячьей сыворотки </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td></tr><tr><td> Nanog миРНК </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 миРНК </td><td> Dharmacon </td><td> D-046256-02 </td></tr><tr><td> Sox2 миРНК </td><td> Dharmacon </td><td> М-058489-01 </td></tr></tbody></table> Управление миРНК: миРНК дуплекс ориентации люциферазы светляков (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) синтезированы Dharamcon.

oct4gip reporter assay to study genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal

Плюрипотентности и самообновления две определяющие характеристики эмбриональных стволовых клеток (ES клетки). Понимание основных молекулярных механизмов значительно облегчит использование ЭС клеток для развития исследований биологии, болезнь моделирования лекарств и регенеративной медицины (обзор в 1,2). Чтобы ускорить выявление и характеристика новых регуляторов ЭС клеток и поддержания самообновления, мы разработали флуоресценции репортера на основе анализа количественно измерить самообновлению статус в ЭС клетки мыши использованием Oct4GiP клеток 3. Oct4GiP клетки экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем Oct4 области промотора гена 4,5. Oct4 требуется для ES клетки самообновлению, и очень выраженная в ЭС клетки и быстро подавляется в процессе дифференцировки 6,7. В результате, GFP выражения и флуоресценции в клетках коррелирует репортер вернос единичной клетки ES 5 и флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) анализ может быть использован внимательно следить за самообновление состояния клетки на одном уровне ячейки 3,8. В сочетании с РНК-интерференции, анализ Oct4GiP репортер может быть использована для быстрого выявления и изучения регуляторов ЭС клеток и поддержания самообновления 3,8. По сравнению с другими методами опробования самообновлению, удобнее, чувствительный, количественный, а также более низкую стоимость. Это может быть осуществлено в 96 - или 384-луночных планшетах для крупномасштабных исследований, таких как высокая пропускная способность экранов или генетического анализа эпистаза. Наконец, с помощью другой линии конкретных репортер линий ES клетки, анализ описанных здесь также может быть изменен, чтобы исследовать судьбу спецификации в процессе дифференцировки клетки ES.

Watch this Scientific Journal Video about Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal at JoVE.com

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Мы описываем флуоресценции анализа репортер быстро идентифицировать и охарактеризовать гены, которые регулируют содержание мышиных эмбриональных стволовых клеток и самообновлению.

Oct4GiP Reporter Анализ по изучению генов, которые регулируют мышиных эмбриональных стволовых клеток обслуживания и Самообновление

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Вывод гемопоэтических стволовых клеток мышей эмбриональных стволовых клеток

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Вывод человеческих эмбриональных стволовых клеток на применение специфических иммунных сывороток в хирургии

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

В пробирке и в естественных Биолюминесценция Reporter Гена изображений из человеческих эмбриональных стволовых клеток

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Культура и поддержание человеческих эмбриональных стволовых клеток

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Использование SC1 (Pluripotin) для поддержки мЭСК Самообновление в отсутствие LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Выделение и Вывод мышиных эмбриональных зародышевых клеток

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Судьба картирование человеческих эмбриональных стволовых клеток на формирование тератома

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Всего монтажа иммуногистохимического анализа для Эмбриональные сосудистой кожи конечностей: модельная система для исследования сосудистой Ветвление Морфогенез в зародыше

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Измененный мышиных эмбриональных стволовых клеток основанных Пробирной для Количественная Кардиогенный эффективность индукционной

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Хроматин Иммунопреципитация Пробирной для тканеспецифические Гены использованием ранней стадии эмбрионы мыши

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...