Name: oct4gip reporter assay to study genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00
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Damos las gracias a Brad Lackford para la lectura y edición del manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental, Institutos Nacionales de Salud, Programa de Investigación Intramural Z01ES102745 (GH).

1. Oct4GiP madre embrionarias de ratón de mantenimiento de la célula Oct4GiP células fueron amablemente proporcionados por el Dr. Austin Smith. Se deriva de los ratones portadores 129/Ola un transgén Oct4-GFPiresPac 4,5. Ellos se mantienen en gelatina placas recubiertas de cultivo de tejidos en el medio ESGRO grado completa más clonal (Millipore), o en el medio M15: DMEM (Invitrogen) suplementado con FBS al 15%, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x para no- aminoácidos esenciales...

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	<li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+differentiation:+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine.">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li><li>Murry, C. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+expression+of+Oct-3/4+defines+differentiation,+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells.">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li><li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity.">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li><li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+cloning+of+Nanog,+a+pluripotency+sustaining+factor+in+embryonic+stem+cells.">Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells.</a> Cell. 113, 643-655 (2003).</li><li>Masui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+governed+by+Sox2+via+regulation+of+Oct3/4+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).</li><li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells.">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li><li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity.">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li><li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+embryonic+stem+(ES)+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor.">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li><li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+embryonic+stem+cell+state.">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li><li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution.">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li><li>Rodda, D. 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El reportero de ensayo Oct4GiP que describimos arriba cuantitativamente se puede medir el grado de auto-renovación frente a la diferenciación. En comparación con otros métodos disponibles, tales como la morfología 12 basada en la proliferación y / ensayos de viabilidad basado, que ofrece una mayor sensibilidad y el rendimiento, así como una medición más directa del estado de células ES. Por tanto, se adapta bien a gran escala pantallas y análisis epistasis genética. De hecho, nosotros y otros han ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> ESGRO de grado medio, y además de clonal </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (glucosa alta 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1001817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (reducir medio de suero) </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> ESGRO primer fondo (10 7 units/1ml) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM AANE (no aminoácidos esenciales) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Nucleósidos 100X para células ES </td><td> Millipore </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M7522-100 ml </td></tr><tr><td> ES-calificado de suero fetal bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td></tr><tr><td> Nanog siRNA </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-046256-02 </td></tr><tr><td> Sox2 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> M-058.489-01 </td></tr></tbody></table> El control de siRNA: dúplex siRNA dirigidos a la luciferasa de luciérnaga (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) sintetizados por Dharamcon.

oct4gip reporter assay to study genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal

Pluripotencia y auto-renovación son dos características que definen a las células madre embrionarias (células ES). Entender el mecanismo molecular subyacente facilitará en gran medida el uso de células madre embrionarias para los estudios de biología del desarrollo, modelos de enfermedades, descubrimiento de fármacos y Medicina Regenerativa (revisado en 1,2). Para agilizar la identificación y caracterización de nuevos reguladores de mantenimiento de células ES y auto-renovación, hemos desarrollado un reportero de fluorescencia de base de ensayo para medir cuantitativamente el estado de auto-renovación en células madre embrionarias de ratón usando las células Oct4GiP 3. Las células Oct4GiP expresar la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de la región promotora del gen Oct4 4,5. Oct4 se requiere para células ES de auto-renovación, y es altamente expresado en células madre embrionarias y rápidamente regulado a la baja durante la diferenciación 6,7. Como resultado, la expresión de GFP y fluorescencia en las células informadoras se correlaciona fielmentecon la identidad de células ES 5, y activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS) el análisis se puede utilizar para controlar estrechamente el estado de auto-renovación de las células en el nivel de células individuales 3,8. Junto con ARNi, el ensayo reportero Oct4GiP se puede utilizar para identificar rápidamente y estudiar los reguladores de mantenimiento de células ES y autorrenovación 3,8. En comparación con otros métodos para el ensayo de auto-renovación, es más conveniente, sensible, cuantitativa, y de menor coste. Puede llevarse a cabo en 96 - o placas de 384-bien para estudios a gran escala, tales como pantallas de alto rendimiento o de análisis de epistasis genética. Finalmente, mediante el uso de otros linaje específico reportero líneas de células ES, el ensayo se describe aquí también se puede modificar para estudiar especificación destino durante la diferenciación de células ES.

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Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Se describe un reportero de ensayo de fluorescencia para identificar rápidamente y caracterizar los genes que regulan el mantenimiento de embriones de ratón con células madre y auto-renovación.

Oct4GiP reportero de ensayo para estudiar los genes que regulan la de embriones de ratón con células madre de mantenimiento y auto-renovación

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Investigación

Biología

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

In vitro e in vivo de imágenes de bioluminiscencia gen reportero de células estaminales embrionarias humanas

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

La cultura y el mantenimiento de células estaminales embrionarias humanas

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

El uso de SC1 (Pluripotin) para apoyar MESC auto-renovación en la ausencia de LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

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El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

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El destino de la asignación de células estaminales embrionarias humanas mediante la formación de teratoma

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Todo el montaje El análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro Vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

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