Name: oct4gip reporter assay to study genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal at JoVE.com

Vi tackar Brad Lackford för att läsa och redigera manus. Denna forskning stöds av National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Interna Research Program Z01ES102745 (till GH).

1. Oct4GiP mus ES-cell Underhåll Oct4GiP celler tillhandahölls vänligen av Dr Austin Smith. De härrör från 129/Ola mössen bär en Oct4-GFPiresPac transgen 4,5. Att den hålls i gelatinbelagda plattor för vävnadsodling i ESGRO fullständigt plus klonal grad medium (Millipore) eller i M15-medium: DMEM (Invitrogen) kompletterat med 15% FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1 x icke- essentiella aminosyror (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore), och 10 ^ M β-merkapto...

<ol>
	<li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+differentiation:+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine.">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations:+lessons+from+embryonic+development.">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li><li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal.">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li><li>Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+potency+by+spontaneous+fusion.">Changing potency by spontaneous fusion.</a> Nature. 416, 545-548 (2002).</li><li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation.">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li><li>Nichols, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+pluripotent+stem+cells+in+the+mammalian+embryo+depends+on+the+POU+transcription+factor+Oct4.">Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.</a> Cell. 95, 379-391 (1998).</li><li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+expression+of+Oct-3/4+defines+differentiation,+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells.">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li><li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity.">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li><li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+cloning+of+Nanog,+a+pluripotency+sustaining+factor+in+embryonic+stem+cells.">Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells.</a> Cell. 113, 643-655 (2003).</li><li>Masui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+governed+by+Sox2+via+regulation+of+Oct3/4+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).</li><li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells.">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li><li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity.">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li><li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+embryonic+stem+(ES)+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor.">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li><li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+embryonic+stem+cell+state.">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li><li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution.">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li><li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2.">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li><li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells.">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li><li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture.">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li></ol>

Den Oct4GiP reporter analysen beskriver vi ovan kan kvantitativt mäta omfattningen av självförnyelse vs differentiering. Jämfört med andra tillgängliga metoder, såsom morfologi-baserade 12 och proliferation / viabilitet-baserade analyser, erbjuder den högre känslighet och genomströmning, såväl som en mer direkt mätning av ES-cellen tillstånd. Det är därför väl lämpad för storskaliga skärmar och genetisk epistasis analys. I själva verket har vi och andra använts framgångsrikt analysen O...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> ESGRO fullständigt plus klonal grad mediet </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (hög glukos 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11.965 </td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25.200 </td></tr><tr><td> Lipofektamin 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1001817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (minska serum medium) </td><td> Invitrogen </td><td> 31.985 </td></tr><tr><td> ESGRO mLIF (10 7 units/1ml) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA (Icke-essentiella aminosyror) </td><td> Invitrogen </td><td> 11.140 </td></tr><tr><td> 100x Nukleosider för ES-cell </td><td> Millipore </td><td> 10.620-1 </td&gt; </tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M7522-100ml </td></tr><tr><td> ES-kvalificerad fetalbovinserum </td><td> Invitrogen </td><td> 10.437 </td></tr><tr><td> Nanog siRNA </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-046.256-02 </td></tr><tr><td> Sox2 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> M-058.489-01 </td></tr></tbody></table> Kontroll siRNA: siRNA duplex målsökande eldflugeluciferas (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) syntetiseras genom Dharamcon.

oct4gip reporter assay to study genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal

Pluripotens och självförnyelse är två utmärkande egenskaper hos embryonala stamceller (ES-celler). Förstå den underliggande molekylära mekanismen kommer i hög grad underlätta användningen av ES-celler för utvecklingsbiologi studier, sjukdom modellering, läkemedelsutveckling och regenerativ medicin (över 1,2). För att påskynda identifiering och karakterisering av nya regulatorer av ES-celler underhåll och självförnyelse, utvecklade vi en fluorescens reporter-baserad analys för att kvantitativt mäta självförnyelse status i mus ES-celler med hjälp av Oct4GiP cellerna 3. De Oct4GiP celler uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av den Oct4 genpromotorregionen 4,5. Oct4 krävs för ES-cell självförnyelse och är mycket uttrycks i ES-celler och snabbt nedregleras under differentiering 6,7. Som ett resultat korrelerar GFP-uttryck och fluorescens i rapportörgenanalysen celler trogetmed ES cellidentitet 5, och fluorescens-cellsortering (FACS) kan analysen användas för att noga övervaka självförnyelse status cellerna vid den enda cellnivå 3,8. Tillsammans med RNAi kan Oct4GiP reporter analysen användas för att snabbt identifiera och studera regulatorer av ES-celler underhåll och självförnyelse 3,8. Jämfört med andra metoder för analys av självförnyelse, är det mer praktiskt, känslig, kvantitativ, och lägre kostnad. Den kan utföras i 96 - eller 384-brunnars plattor för omfattande undersökningar, såsom hög genomströmning skärmar eller genetisk epistasis analys. Slutligen, genom användning av andra härstamning-specifika reportern ES-cellinjer kan analysen som beskrivs här också modifieras för att studera ödet specifikation under ES-celldifferentiering.

Watch this Scientific Journal Video about Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal at JoVE.com

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Vi beskriver en fluorescens reporter analys att snabbt identifiera och karakterisera gener som reglerar musen embryonala underhåll stamceller och själv-förnyelse.

Oct4GiP Reporter analys för att studera gener som reglerar Mouse embryonala Underhåll Stem Cell och självförnyelse

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Härledning av hematopoetiska stamceller från Murine embryonala stamceller

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivering av mänskliga embryonala stamceller genom Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

In vitro och in vivo mareld Reporter Gene avbildning av mänskliga embryonala stamcellslinjer

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Kultur och underhåll av mänskliga embryonala stamcellslinjer

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Användningen av SC1 (Pluripotin) för att stödja Mesc självförnyelse i frånvaro av LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolering och Härledning av Mouse Embryonala Germinal celler

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Ödet Kartläggning av mänskliga embryonala stamcellslinjer som Teratom Bildning

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Hela montering Immunhistokemisk Analys för Embryonala Limb Skin kärlsystemet: ett modellsystem för studier Vascular Avgrening morfogenes i Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Ändrad Mus embryonala stamceller baserad analys för att kvantifiera Kardiogen induktion Effektivitet

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Kromatin Immunoprecipitation analys för Tissue-specifika gener med början av karriären musembryon

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...