Name: a faster, high resolution, mtpa-gfp-based mitochondrial fusion assay acquiring kinetic data of multiple cells in parallel using confocal microscopy
Uploaded: 2012-07-20T12:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy at JoVE.co

نشكر مركز تافتس للبحوث علم الأعصاب، P30 NS047243 (جاكسون)، وبحوث الانجذاب الميتوكوندريا التعاونية (mtARC) بدعم من مركز ايفانز للبحوث الطبية الحيوية في التخصصات الطبية في بوسطن الحرم الجامعي، وصلة مؤسسة الطب، وزايس لدعم هذا العمل.

1. صورة طبق التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة INS1 الخلايا في وسائل الإعلام التي تحتوي على مستوى RPMI الجنين بنسبة 10٪ مصل بقري، 1٪ البنسلين، الستربتومايسين، 2 مم L-الجلوتامين، 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول، 5 مم NaHCO 3، 2 HEPES مم، حمض البيروفيك 2 ملم، و 11 مللى جلوكوز إلى التقاء 80٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الثقافات الخلية INS1 مع التربسين 0.05٪، وطبق لهم على بولي-D-يسين المغلفة لوحات التصوير ساترة القاع (30-40 التقاء٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لوحات للوصول إلى نقطة التقاء 60-80٪ (~ 2 أيام) وإضافة مصفوفة الميتوكوندريا المستهدفة (COXVIII) الفيروسة الغدانية PA-GFP لمدة 24 ساعة (وزارة الداخلية = 5). وسائل الاعلام والسماح لتبادل الخلايا في النمو لمدة يوم 2 قبل التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من التصوير، إضافة 7-15 TMRE نانومتر إلى لوحات التصوير، ويوازن ما لا يقل عن 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال هذا الوقت على دور الحاضنة (وقد استخدمت مرحلة أعلى حاضنة هنا) والسماح للمجهر لكي تتوازن إلى 37 درجة مئوية لمدة حوالي 1 ساعة. بدوره على ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2. </لى&gt; </ol> 2. معلمات التصوير للمجهر زايس 710 LSM متحد البؤر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مجهر لديه معايرتها، تحت علامة التبويب اكتساب، انقر على &quot;أدوات عرض دليل&quot;، وفتح التصوير إعداد الفريق، واختيار &quot;قناة واسطة&quot; والتبديل تتبع كل &quot;الإطار&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في لوحة مسار الضوء، واختيار LSM ووضع قناة. العمل من رمز عينة التصاعدي، حدد &quot;الخلفية&quot;، MBS 690 +، وMBS 488. في الجزء السفلي من لوحة، واختيار &quot;T-PMT&quot; لتمكين التصور من مجال مشرق أو قناة مدينة دبي للإنترنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتهاء من تعديل مسار ضوء المعلمات عن طريق تحديد النطاق للصبغ GFP إلى 490-540 نانومتر، وإلى 580-700 نانومتر لصبغ TMRE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وضع حيازة واستخدام 512 × 512 بكسل مجال المسح الضوئي، 4x ومتوسط، واختيار عامل التكبير (والتي قد ترغب في الاحتفاظ بما يتفق لأغراض المعايرة). </li></ol> 3. تحقيق الاستفادة المثلى من معلمات التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام خطة لامزيغ 100X (1.4 NA) هدف عدسة، FOCلنا في الخلايا الخاصة بك مع ضوء الهالوجين، وليس ضوء الفلورسنت، لحماية الميتوكوندريا من الضيائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شاشة للسلطة الفلسطينية، معربا عن GFP الخلايا باستخدام ذات الثقب مفتوحة الى اقصى حد ممكن والمسح الضوئي للعثور على الخلايا التي هي أكثر إشراقا الخضراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على أدنى قوة ليزر 2-الفوتون اللازمة لتفعيل السلطة الفلسطينية وGFP وتحسين المعلمات التصوير ضمان أن يكون إشارة لا تشبع كاشف. تأكد من أن إشارة PA-GFP colocalizes مع الإشارة TMRE لسلسلة-Z قليلة. خسارة للإشارة إلى الاستقطاب TMRE الميتوكوندريا أو الضيائية، والخلايا العارضة لا ينبغي أن تستخدم هذه الخصائص للتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على خلية للسلطة الفلسطينية، معربا عن GFP وتحديد عامل التكبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين نطاق Z-سلسلة لجمع 6 شرائح (هذا النطاق سوف تحتاج إلى تلبية جميع الخلايا 10 ما لم يتم تعيين محدد Z-التركيز في كل موقف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ طريقة التصوير لكل خلية (خلية 1، الخلية 2 وما إلى ذلك). </li></ol> 4. ضبط آليد الجزء من البرنامج ويعين خلايا 10 سوف تتبع لفحص ساعة 1 فيوجن الميتوكوندريا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اللوحة اليسرى من النافذة multitime، حدد &quot;حفظ&quot; لوحة، وتحديد الموقع الذي سيتم فيه حفظ الملفات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في لوحة &quot;شراء&quot;، تحميل طريقة اكتساب حفظها للخلية 1 في تكوين المسح الضوئي والتحقق من المربع مكدس ض. أيضا اختيار &quot;علامة Z-وسط كومة Z&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في لوحة &quot;لبنات&quot;، حدد &quot;كتلة واحدة في كل مكان&quot;. انقر على &quot;كتل إضافة&quot; لكل فترة إلى أن يقاس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في لوحة &quot;توقيت&quot;، حدد &quot;الانتظار الفاصلة&quot; ونوع &quot;0&quot; في &quot;فترة الانتظار قبل كتلة في الموقع الأول فقط&quot;. وسوف كتل 2-4 لديهم &quot;15 دقيقة&quot; في هذا القسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في لوحة الموقع، واختيار &quot;نقل التركيز إلى تحميل الموقف بين المواقع&quot; و &quot;تحميل مسح التكوين عندما &#39;نقل إلى الموضع&quot; أو النقر على &quot;التالي الموضع&quot;. وبموجب &quot;لائحة المواقع تحرير&quot; اختر &quot;مسح جميع&quot;، ومن ثم تحديد &quot;متعددة المواقع بمحركات المرحلة &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اوندإيه &quot;بليتش&quot; لوحة، انقر على &quot;تبييض&quot; مربع، وتعيين ملف التكوين في &quot;التكوين&quot; سحب أسفل القائمة، على النحو المحدد في إطار البرنامج الرئيسي. ثم، في إطار &quot;التبييض&quot;، حفظ طريقة تنشيط ضوئي مناسب. في لوحة المناطق، واختيار العائد على الاستثمار لهذه الخانة بصفة خاصة، وإضافة هذا العائد على الاستثمار إلى multitime عن طريق اختيار &quot;المنطقة الحالية إضافة إلى عائد الاستثمار قائمة&quot; نافذة. تأكد من تحديد الموقع نفسه في &quot;ROI&quot; سحب أسفل القائمة. </li></ol> بالنسبة لتوقيت للعمل بشكل صحيح، ولكل خلية أن يكون الفاصل الزمني 15 دقيقة، واثنين من الطرق بحاجة ليتم حفظها. في قائمة الكتل، وسوف يكون أول واحد &quot;الحقيقي&quot; تكوين تنشيط ضوئي، والباقي سيكون لها &quot;وهمية&quot; التكوين الذي لا يستخدم ليزر ثنائي الفوتون. سيكون اللبنة الأولى أيضا أن تكون الكتلة الوحيدة التي ليس لديها تأخير (BKIntv = 0). ولذلك، فإن الطريقة يبدأ مسح خط الأساس واحد، يتبعه فحص تنشيط ضوئي. ما تبقى من كتل لديها 900 ثانية BkIntv، وفي كل نقطة زمنية هناك نوعان من المسح تماما كما في الوقت 0 ثانية، للحفاظ على اتساق توقيت. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل واحد من الخلايا 10 التي يتعين اتباعها مع مرور الوقت، تنفيذ هذا التسلسل: العثور على PAGFP معربا عن خلية حفظ منهجه التصوير موقع لوحة، بمناسبة موقف مرحلة، وتحديد طريقة التصوير الرئيسية ROI لوحة، اختيار المنطقة من اهتمام لتكون لوحة بليتش photoactivated-ROI حفظ محددة، وأيضا تحميله في المربع العائد على الاستثمار: محو العائد على الاستثمار وإعادة تعيين التكبير المسح إلى 1 العثور على الخلية التالية وتعيين التكبير تكرار هذه العملية للحصول على الخلايا 9 التالي </li></ol> تأكد من أن كل موقع ويمنع كل مرحلة لها أسلوب التصوير المناسبة (مسح التكوين) المرتبطة بها. أيضا التأكد من أن كتلة الأول في كل موقع يتوافق مع طريقة تنشيط ضوئي مناسبة في حين أن بقية تحتوي على &quot;وهمية&quot; الأسلوب. أخيرا، حدد &quot;تشغيل&quot;. 5. تحليل قوة إشارة PA-GFP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><lأنا&gt; للحصول على الخلايا التي في إشارة photoactivatable-GFP colocalizes مع الإشارة TMRE أحمر، طرح الخلفية في الصور PAGFP (هنا نستخدم metamorph). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تصدير البيانات إلى Excel وحساب متوسط ​​كثافة لZ-المداخن في كل نقطة زمنية. تجاهل المقاطع البصرية التي ليس لها إشارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس التخفيف إشارة في كل Z-كومة من حساب النسبة المئوية للإشارة إلى photoactivated الأصلي. </li></ol> يتم فحص كل نقطة بيانات وسجلت مرتين، مما أدى إلى معلومات Z-كومة مكررة عن كل نقطة زمنية. تحقق من أن القيم Z-كومة توافق. إن لم يكن، وهذا يدل على وجود مشكلة (على سبيل المثال حركة التركيز الخلية،). 6. ممثل النتائج عندما حدث اندماج يحدث بين الحبيبات الخيطية PA-GFP تفعيلها وعدم تفعيلها، وPAGFP داخل المصفوفة الميتوكوندريا تختلط مع مصفوفة غير المسمى، وتصبح مخففة على مساحة أكبر، والحد من إشارةكثافة (الشكل 1A). في الخلية INS1، حدوث انخفاض كبير في كثافة إشارة يحدث كل 15 دقيقة، حتى تم التوصل إلى موازنة من الانصهار الميتوكوندريا (حوالي 1 ساعة). لاحظ أن الخلية في الشكل 1B يسلك colocalization شبه كاملة من السلطة الفلسطينية وGFP وإشارات TMRE. في هذه القياسات لتركيز منخفض جدا من TMRE (15 نانومتر) ويستخدم للمساعدة في استهداف تنشيط ضوئي من PAGFP، وأيضا لرصد صحة الخلية. والخلايا مع وفرة من الميتوكوندريا استقطابها لديها colocalization غير مكتملة من PAGFP وTMRE، وينبغي ألا يكون ذلك بسبب تحلل وهذا يدل إما الضيائية، أو الخلايا في حالة الموت. الوقت موازنة للانصهار الميتوكوندريا هي عادة 1 ساعة في INS1 الخلايا، وعندما يتم تنشيط ~ 15٪ من حجم الميتوكوندريا. في بعض الأحيان، حتى لو كان يضيء مساحة صغيرة، ومعظم من الميتوكوندريا أصبح photoactivated بسبب وجود اتصالات للغاية، وفي هذه الحالة مزيد من الاندماج يصعب اكتشاف. قد أنواع الخلايا الأخرى تظهر مرة موازنة مختلفة، وينبغي اختبار على فترات أقصر وعلى مدى فترة أطول لوصف ديناميات الميتوكوندريا. لمنع انصهار الميتوكوندريا، يمكن وضع الخلايا ضمن بيئة lipotoxic. فقد سبق أن بينت أن 0.4 ملم بالميتات شظايا الميتوكوندريا، ويمنع الانصهار الميتوكوندريا 9. ويمكن ملاحظة هذا التأثير في الشكل 2، حيث يتم تجزئة الميتوكوندريا، ولكن كثافة إشارة mtPAGFP لا تتغير بقدر ما في ظل الظروف العادية (الشكل 1). ولذلك، فإن التخفيف من الإشارة PA-GFP من المرجح أن يكون راجعا إلى الاندماج الميتوكوندريا بدلا من الانشطار. في أنواع الخلايا الأخرى، نقترح استخدام طرق أخرى معروفة للحث على تجزئة الميتوكوندريا، مثل إسكات OPA1 وهو أمر ضروري لاندماج الميتوكوندريا 14. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3991/3991fig1.jpg" /> الشكل 1. </stroنانوغرام&gt; تخفيف نموذجي للإشارة PA-GFP بعد تنشيط ضوئي خلال فحص الانصهار الميتوكوندريا. ألف PA-GFP يصبح تدريجيا باهتة بسبب الأحداث الانصهار الميتوكوندريا مما يؤدي إلى التخفيف من البروتين على مساحة متزايدة، حيث يمكن أن تشاهد في هذه الصور المتوقعة من 6 أقسام بصري كميا كل 15 دقيقة. باء TMRE مع السلطة الفلسطينية وGFP يدل على أن الميتوكوندريا وينشط وليس استقطابها. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig1large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3991/3991fig2.jpg" /> الشكل 2. الميتوكوندريا تحول دون الاندماج مع بالميتات 0.4 ملي يقلل من التخفيف من السلطة الفلسطينية وGFP. التوقعات ألف من 6 أقسام البصرية تظهر الميتوكوندريا قصيرة مع كثافة إشارة لا تتغير مع مرور الوقت. باء Colocalization من السلطة الفلسطينية وGFP مع TMRE يدل على ان الميتوكوندريا لا ديالاستقطاب. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig2large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> .

<ol>
	<li>Braschi, E., McBride, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+the+culture+of+the+Borg:+understanding+the+integration+of+mitochondrial+function+within+the+reticulum,+the+cell,+and+the+organism.">Mitochondria and the culture of the Borg: understanding the integration of mitochondrial function within the reticulum, the cell, and the organism.</a> Bioessays. 32, 958-966 (2010).</li><li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+dynamic+organelles+in+disease,+aging,+and+development.">Mitochondria: dynamic organelles in disease, aging, and development.</a> Cell. 125, 1241-1252 (2006).</li><li>Chan, D. C., Detmer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics.">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).</li><li>Han, X. J., Tomizawa, K., Fujimura, A., Ohmori, I., Nishiki, T., Matsushita, M., Matsui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+dynamics+and+neurodegenerative+diseases.">Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases.</a> Acta Med Okayama. 65, 1-10 (2011).</li><li>Huang, H., Choi, S. Y., Frohman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+mitochondrial+fusion+using+Renilla+luciferase+complementation.">A quantitative assay for mitochondrial fusion using Renilla luciferase complementation.</a> Mitochondrion. 10, 559-566 (2010).</li><li>Karbowski, M., Arnoult, D., Chen, H., Chan, D. C., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+mitochondrial+dynamics+by+photolabeling+of+individual+organelles+shows+that+mitochondrial+fusion+is+blocked+during+the+Bax+activation+phase+of+apoptosis.">Quantitation of mitochondrial dynamics by photolabeling of individual organelles shows that mitochondrial fusion is blocked during the Bax activation phase of apoptosis.</a> J. Cell. Biol. 164, 493-499 (2004).</li><li>Legros, F., Lombes, A., Frachon, P., Rojo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+in+human+cells+is+efficient,+requires+the+inner+membrane+potential,+and+is+mediated+by+mitofusins.">Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofusins.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 4343-4354 (2002).</li><li>Molina, A. J., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+mitochondrial+dynamics+with+photoactivatable+[corrected]+green+fluorescent+protein.">Monitoring mitochondrial dynamics with photoactivatable [corrected] green fluorescent protein.</a> Methods Enzymol. 457, 289-304 (2009).</li><li>Molina, A. J., Wikstrom, J. D., Stiles, L., Las, G., Mohamed, H., Elorza, A., Walzer, G., Twig, G., Katz, S., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+networking+protects+beta-cells+from+nutrient-induced+apoptosis.">Mitochondrial networking protects beta-cells from nutrient-induced apoptosis.</a> Diabetes. 58, 2303-2315 (2009).</li><li>Otera, H., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+physiologic+functions+of+mitochondrial+dynamics.">Molecular mechanisms and physiologic functions of mitochondrial dynamics.</a> J. Biochem. 149, 241-251 (2011).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297, 1873-1877 (2002).</li><li>Schauss, A. C., Huang, H., Choi, S. Y., Xu, L., Soubeyrand, S., Bilodeau, P., Zunino, R., Rippstein, P., Frohman, M. A., McBride, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+mitochondrial+fusion+assay+amenable+for+high-throughput+screenings+of+fusion+modulators.">A novel cell-free mitochondrial fusion assay amenable for high-throughput screenings of fusion modulators.</a> BMC Biol. 8, 100 (2011).</li><li>Sheridan, C., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fission/fusion+dynamics+and+apoptosis.">Mitochondrial fission/fusion dynamics and apoptosis.</a> Mitochondrion. 10, 640-648 (2010).</li><li>Twig, G., Elorza, A., Molina, A. J., Mohamed, H., Wikstrom, J. D., Walzer, G., Stiles, L., Haigh, S. E., Katz, S., Las, G., Alroy, J., Wu, M., Py, B. F., Yuan, J., Deeney, J. T., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+and+selective+fusion+govern+mitochondrial+segregation+and+elimination+by+autophagy.">Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy.</a> EMBO J. 27, 433-446 (2008).</li><li>Twig, G., Graf, S. A., Wikstrom, J. D., Mohamed, H., Haigh, S. E., Elorza, A., Deutsch, M., Zurgil, N., Reynolds, N., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tagging+and+tracking+individual+networks+within+a+complex+mitochondrial+web+with+photoactivatable+GFP.">Tagging and tracking individual networks within a complex mitochondrial web with photoactivatable GFP.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C176-C184 (2006).</li><li>Twig, G., Hyde, B., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion,+fission+and+autophagy+as+a+quality+control+axis:+the+bioenergetic+view.">Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1777, 1092-1097 (2008).</li><li>Twig, G., Liu, X., Liesa, M., Wikstrom, J. D., Molina, A. J., Las, G., Yaniv, G., Hajnoczky, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+properties+of+mitochondrial+fusion+events+in+pancreatic+beta-cells+and+cardiac+cells+unravel+potential+control+mechanisms+of+its+selectivity.">Biophysical properties of mitochondrial fusion events in pancreatic beta-cells and cardiac cells unravel potential control mechanisms of its selectivity.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, C477-C487 (2010).</li><li>Twig, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+between+mitochondrial+dynamics+and+mitophagy.">The interplay between mitochondrial dynamics and mitophagy.</a> Antioxid. Redox Signal. 14, 1939-1951 (2011).</li></ol>

وترعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المادة من قبل زييس، وشركة

هذه الطريقة تسمح للتصوير حوالي 10 خلايا في كل مرة، إذا كان اكتساب يحدث كل 15 دقيقة بعد تنشيط ضوئي. والعدد الدقيق للخلايا تعتمد على مدى سرعة واحد قادر على تحديد مكان واحياء خلايا mtPAGFP التعبير داخل صحن والثقافة، ومدى السرعة التي يمكن للمرء أن إعداد جميع المعلمات البرمجيات. وينبغي لجعل الآلي بسلاسة أن تستخدم طبقة من الخلايا حتى لأن المعين Z-كومة هوامش سوف تطبق على جميع الخلايا. وحجم هذا المجال تنشيط ضوئي الأولية تحكم وقت موازنة. لتكون قادرة على قياس انصهار الميتوكوندريا، من المهم أن photoactivate فقط 10-20٪ من الشبكة، بحيث يمكن رصد انتشار إشارة إلى بقية الشبكة مع مرور الوقت. إذا photoactivated الكثير من الشبكة، فمن الممكن أن الاندماج الكامل سوف تحدث بسرعة كبيرة جدا، وسوف لن يتم القبض على هذا الحدث. يجب توخي الحذر الشديد لضبط قوة الليزر ليزر ثنائي الفوتون، فضلا عن تركيز TMRE لتجنب الضيائية الأمر الذي يؤدي إلى إزالة الاستقطاب الميتوكوندريا. ويمكن التأكد من أن إشارة mtPAGFP colocalizes مع الإشارة TMRE مساعدة في تقييم الضيائية والصحة العامة الخلية 8،15. وينبغي تجنب الإضاءة مع ضوء epifluoerescent. في حين تبحث عن الخلايا معربا عن mtPAGFP، ينبغي أن تكون مفتوحة ذات الثقب الحد الأقصى في حين مسح مع إثارة قوة 488nm منخفض. تعديل قوة الليزر ثنائي الفوتون إلى photoactivate ما يكفي من السلطة الفلسطينية وGFP لقياس إشارة أكثر من 1 ساعة ولكن ليس لoversaturate أي من الخلايا يمكن أن تكون خادعة 8. ومع ذلك، ينبغي أن أمضى بعض الوقت في هذه الخطوة الأمثل لبدء برنامج الآلي مرة واحدة، فمن شاقة لوقف ذلك، لاختيار أكثر من الخلايا، واستئناف. لمراقبة الجودة، والحصول على فارق المقابل تدخل (DIC) يمكن أن صورة (أو الضوء المرسل) لمراقبة التركيز على أن تكون خلايا جدامن المفيد أيضا وسيلة جيدة للكشف عن الفقاعات تشكلت في غمر النفط خلال المسح الضوئي، وهذا يحدث في بعض الأحيان من حركات المرحلة. على الرغم من أن استخدام هذا الأسلوب mtPAGFP تجمع البيانات على حركة أحادي الاتجاه للبروتينات الميتوكوندريا المصفوفة من الميتوكوندريا photoactivated إلى تلك التي لا المسمى، فإنه من الممكن تصور للاستفادة من هذه التقنية لدراسة العمليات الأخرى. على سبيل المثال، يمكن إرفاق fluorochromes محددة للبروتينات غشاء لمراقبة حركتهم محددة خلال أحداث الانصهار، كما ثبت عن ABC-لي، وانصهار والذي يحدث على نطاق وزمنية مختلفة من خلط للبروتينات قابلة للذوبان مصفوفة 15.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> COXIII الفيروسة الغدانية-PA-GFP </td><td> الدكتور يبينكوت-شوارتز </td><td></td></tr><tr><td> TMRE </td><td> إينفيتروجن </td><td> T669 </td></tr><tr><td> زييس LSM 710 مبائر </td><td> زييس </td><td></td></tr></tbody></table>

a faster, high resolution, mtpa-gfp-based mitochondrial fusion assay acquiring kinetic data of multiple cells in parallel using confocal microscopy

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.
Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function18. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust14. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis9. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.
Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay7, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process 4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.
A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal6. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.
The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity8,15,16,17.
In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE8 in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO2, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Watch this Scientific Journal Video about A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy at JoVE.co

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

وقد تم قياس انصهار الميتوكوندريا من خلال تتبع من موازنة GFP المصفوفة التي تستهدف photoconverted عبر الشبكة الميتوكوندريا مع مرور الوقت. حتى الآن، يمكن أن تتعرض خلية واحدة فقط لتحليل الحركية ساعة طويلة في وقت واحد. نقدم أسلوب الذي يقيس خلايا متعددة في وقت واحد، بذلك تسرع من عملية جمع البيانات.

أسرع وارتفاع القرار، وطن متري سنويا، GFP القائم على الفحص فيوجن الميتوكوندريا الحصول على بيانات حركية من خلايا متعددة في طريق موازية متحد البؤر المجهري

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

تحليل الانصهار الغشاء بوساطة كمين باستخدام الانصهار خلية الفحص الانزيمي

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

في وقت واحد قياس درجة الحموضة في التقامي وعصاري خلوي المقصورات في الخلايا الحية باستخدام متحد البؤر المجهري

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

عالية الدقة قياس التنفس لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في Permeabilized وخلايا سليمة

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

الجمع بين الخلية الانقسامية المزامنة وعالية الدقة [كنفوكل] الفحص المجهري لدراسة دور البروتينات المتعددة الوظائف دورة الخلية أثناء الانقسام

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

ريسبيروميتري عالية الدقة لقياس الوظيفة المتقدرية سليمة من خلايا بيتا حضور المركبات الطبيعية

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

متوازي عالية الإنتاجية واحد جزيء واحد اختبار حركي لشق الحمض النووي الموقع محددة

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...