Name: a faster, high resolution, mtpa-gfp-based mitochondrial fusion assay acquiring kinetic data of multiple cells in parallel using confocal microscopy
Uploaded: 2012-07-20T12:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy at JoVE.co

Biz Neuroscience Araştırma Merkezi Tufts, P30 NS047243 (Jackson), Boston Üniversitesi Tıp Kampüsü, Link Tıp Corporation Disiplinlerarası Biyomedikal Araştırma Evans Center tarafından desteklenen Mitokondri Affinity Araştırma Ortak (mtARC) ve bu çalışmaları desteklemek için Zeiss teşekkür ederim.

1. Görüntü Plaka Hazırlık <ol><li> % 10 fetal bovin serumu, standart,% 1 penisilin streptomisin, 2 mM L-glutamin, 50 uM 2-merkaptoetanol, 5 mM NaHCO 3, 2 mM HEPES, 2 mM piruvik asit, ve 11 mM glukoz ihtiva eden RPMI ortamında kültüre INS1 hücreleri % 80 izdiham için. </li><li> % 0.05 tripsin ve plakası ile poli-D-lizin kaplı coverslip dipli görüntüleme plakaları (% 30-40 izdiham) üzerine olan INS1 hücre kültürleri Trypsinize. </li><li> Plakalar% 60-80 izdiham (~ 2 gün) ulaşmak ve mitokondrial matriks hedef eklemek için izin ver (COXVIII) için adenoviral PA-GFP 24 saat (İçişleri Bakanlığı = 5). Değişim medya ve hücreleri görüntüleme önce başka bir 2 gün büyümeye olanak sağlar. </li><li> Görüntüleme gününde görüntüleme plakaları 7-15 nM TMRE ekleyin ve en az 45 dakika dengeye. </li><li> Inkübatör bu sefer dönüş (evre üst inkübatör burada kullanılmıştır) sırasında ve mikroskop ° C&#39;de yaklaşık 1 saat 37 denge sağlaması için bekletin. % 5 CO 2 açın. </li&gt; </ol> 2. Zeiss LSM 710 Konfokal Mikroskop Görüntüleme Parametreler <ol><li> Mikroskop dengelenmiş sahip sonra, Toplama sekmesi altında, &quot;show el aletleri&quot; linkine tıklayın görüntüleme paneli kurmak açın ve &quot;kanal modu&quot; seçeneğini seçin ve her bir &quot;çerçeve&quot; takip geçiş. </li><li> Işık yolu panelinde, EKK ve kanal modunu seçin. Örnek simgesinden Çalışma yukarı, 690 +, ve MBS 488 &quot;arka&quot;, MBS seçin. Panelin alt kısmında, parlak saha veya DIC kanalının görselleştirme sağlamak için &quot;T-PMT&quot; tercih. </li><li> 490-540 nm ve TMRE boya için 580-700 nm GFP boya için aralığı ayarlayarak ışık yolu parametrelerini ayarlayarak bitirin. </li><li> Satın alma modunda, × 512 piksel tarama alanı, ortalama 4x 512 kullanın ve yakınlaştırma faktörü (Eğer kalibrasyon amaçlı tutarlı tutmak istiyor olabilir) seçin. </li></ol> 3. Görüntüleme Parametreleri Optimize <ol><li> Diz, (1.4 NA) 100x objektif lens planı apochromat kullanmafototoksisite gelen mitokondri korumak için halojen ışık değil, floresan ışık, ile hücreler bizi. </li><li> PA-GFP bir maksimum açık iğne deliği kullanarak hücrelerin ifade ve parlak yeşil hücreleri bulmak için tarama için ekran. </li><li> PA-GFP aktif hale getirmek ve doyurmak sinyal detektör etmediğini sağlanması görüntüleme parametreleri optimize etmek için gerekli 2-foton lazer en düşük güç ara. PA-GFP sinyali birkaç z serisi için TMRE sinyali ile colocalizes olmadığını kontrol edin. TMRE sinyal kaybı mitokondriyal depolarizasyon veya fototoksisite gösterir ve hücrelerin bu özellikleri analiz için kullanılmamalıdır sergiliyor. </li><li> Bir PA-GFP eksprese eden hücre bulun ve yakınlaştırma faktörü belirtin. </li><li> 6 dilim (belirli bir z-odak her pozisyonda ayarlanmadığı sürece bu aralığın tüm 10 hücre karşılamak gerekir) toplamak için Z-serisi aralığı ayarlayın. </li><li> Her hücre (hücre 1, hücre 2 vb) görüntüleme yöntemi kaydedin. </li></ol> 4. Otomatikleştir ayarlayınd Programı Taksit ve Sen 1 Saat Mitokondrial Füzyon Deneyi için Will Follow 10 Hücreleri belirtin <ol><li> Multitime pencerenin sol panelinde, &quot;tasarruf&quot; paneli seçin ve dosyaların kaydedileceği konumu belirtin. </li><li> &quot;Toplama&quot; panelinde, tarama yapılandırma hücre 1 için kaydedilen alma yöntemi yüklemek ve z yığını onay kutusunu işaretleyin. Ayrıca &quot;z yığını Z-orta işaretlenmiş&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Bloklar&quot; panelinde, &quot;Her yerde tek bir blok&quot; seçeneğini seçin. Ölçülecek her aralığı için &quot;add blok&quot; a tıklayın. </li><li> &quot;Zamanlama&quot; panelinde, &quot;ilk konumu yalnızca az blok öncesi bekleme aralığı&quot; olarak &quot;aralık bekleyin&quot; ve &quot;0&quot; seçeneğini seçin. Bloklar 2-4 Bu bölümdeki &quot;15 dakika&quot; olacaktır. </li><li> Konumu panelinde, seçim &quot;lokasyonlar arasında pozisyon yüklemek için odak taşımak&quot; ve çok &quot;seçin ve&quot; tümünü temizlemek düzenleme yerler listesi &quot;tercih&quot; &quot;yük veya &#39;sonraki loc&#39; tıklayan &#39;loc geçmek&#39; zaman altında. Config tarama&quot; yerlerde &quot;sahne motorlu. </li><li> Under &quot;Bleach&quot; paneli, &quot;çamaşır suyu&quot; kutusunu tıklatın ve &quot;config&quot; yapılandırma dosyası tayin menü aşağı çekme gibi temel yazılım penceresinde belirlenir. Sonra, &quot;bleaching&quot; penceresinde, uygun fotoaktivasyon yöntemi kaydedin. Bölgelerde panelinde, bu özel hücre için ROI seçin ve pencere &quot;ROI listesine eklemek geçerli bölge&quot; seçerek multitime bu ROI ekleyin. Menüyü aşağı doğru &quot;ROI&quot; aynı konumu seçin emin olun. </li></ol> Zamanlama düzgün çalışması için ve her hücrenin bir 15 dakikalık aralıklarla olması için, iki yöntem kaydedilmesi gerekir. Blok listesinde, ilk &quot;gerçek&quot; fotoaktivasyon yapılandırma olacak ve geri kalan iki-foton lazer kullanan bir &quot;taklit&quot; yapılandırma olacaktır. Ayrıca, birinci blok (= 0 BKIntv) bir gecikme sahip değildir, sadece blok olacaktır. Dolayısıyla, yöntem, bir tarama fotoaktivasyon takiben bir baz tarama ile başlar. Blokların kalanı 900 sn BkIntv var veher noktada zamanlama tutarlılığı korumak için tıpkı süresi 0 sn iki tarama vardır. <ol start="7"><li> Zaman içinde takip edilmesi gereken 10 hücrelerin her biri için, bu sıra gerçekleştirin: Ifade eden bir PAGFP bul kendi görüntüleme yöntemi hücre kaydetmek Yer sahne pozisyon paneli-işaretlemek, görüntüleme yöntemi belirtin Ana ROI panel seçim özel ROI paneli-kaydedebilir ve aynı zamanda yatırım getirisini kutusuna yüklemek photoactivated Bleach olmak için ilgilenilen bölge: ROI Erase ve 1 tarama zum sıfırlamak Sonraki hücre bulun ve zoom ayarı Sonraki 9 hücreler için işlemi tekrarlayın </li></ol> Her aşamada yer ve tüm blokları ilişkili uygun görüntüleme yöntemi (tarama yapılandırma) olduğundan emin olun. Ayrıca geri kalan bir &quot;taklit&quot; yöntemi içeren süre her yerde ilk blok uygun fotoaktivasyon yöntemine karşılık emin olun. Son olarak, &quot;Çalıştır&quot; seçeneğini seçin. 5.. PA-GFP Sinyal yoğunluğu analiz <ol><li&gt; photoactivatable-GFP sinyali kırmızı TMRE sinyali ile colocalizes hangi hücreler için, PAGFP görüntüleri (burada Metamorph kullanın) arka plan çıkarmak. </li><li> Sonra excel verileri ve her zaman noktasında z-yığınlar için ortalama yoğunluğunu hesaplamak. Herhangi bir sinyal var optik bölümleri atın. </li><li> Orijinal photoactivated sinyalinin yüzdesi hesaplanarak, her z-yığın sinyali seyreltme ölçün. </li></ol> Her bir veri noktası, her bir zaman noktası için çift z-yığın bilgileri ile sonuçlanan, iki kez taranan ve kaydedilmektedir. Z-yığın değerleri kabul olmadığını kontrol edin. Eğer değilse, bu bir sorun (örneğin odağı, hücre hareketi) göstergesidir. 6. Temsilcisi Sonuçlar Bir füzyon olayı aktive ve aktive olmayan PA-GFP mitokondri arasında oluştuğunda, mitokondrial matriks içinde PAGFP olmayan etiketli matriks ile karıştırır ve daha geniş bir alana seyreltilmiş olur, sinyal azalanyoğunluğu (Şekil 1A). Mitokondriyal füzyon dengelenme (yaklaşık 1 saat) ulaşıncaya kadar INS1 hücresinde, sinyal yoğunluğunda önemli bir azalma, her 15 dakikada gerçekleşir. Şekil 1B hücre PA-GFP ve TMRE sinyallerin hemen hemen tam ko sergileyen dikkat ediniz. Bu yöntemlerde TMRE çok düşük bir yoğunluğu (15 nM) ile PAGFP fotoaktivasyon hedef yardımcı olmak için, ve aynı zamanda hücre sağlığı izlemek için kullanılır. Bu da fototoksisite veya ölmekte olan bir devlet hücreleri gösterir, çünkü depolarize mitokondri bir zenginliği ile Hücreleri PAGFP ve TMRE eksik kolokalizasyon sahip olacak ve analiz edilmesi gerekir. ~ Mitokondriyal hacminin% 15 aktif olduğunda mitokondriyal füzyon için Denge süresi genellikle INS1 hücrelerde 1 saat. Bazen, küçük bir alanda aydınlatılır bile, mitokondrinin en dolayı daha da füzyon tespit etmek zordur, bu durumda son derece, ağ olmak üzere photoactivated haline. Diğer hücre tipleri farklı alışım kez gösterebilir ve mitokondriyal dinamiğini karakterize etmek için kısa aralıklarla ve uzun bir süre boyunca test edilmelidir. Mitokondriyal füzyon inhibe etmek için, hücreler, bir lipotoxic ortam içinde yerleştirilebilir. Bu, daha önce 0.4 mM fragmanları mitokondri palmitat olduğunu gösterdi, ve mitokondriyal füzyon 9 inhibe edilmiştir. Bu etki, mitokondri parçalanmış Şekil 2, görülebilir, fakat mtPAGFP bir sinyal normal koşullar (Şekil 1) altına kadar değişmez. Bu nedenle, PA-GFP sinyali seyreltme yerine bölünme daha mitokondriyal füzyon bağlı olması olasıdır. Diğer hücreler türleri, biz böyle mitokondriyal füzyon 14 için gerekli olan OPA1 susturmak gibi mitokondriyal parçalanma uyardığı bilinen diğer yollarla kullanmanızı öneririz. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3991/3991fig1.jpg" /> Şekil 1.. </strong&gt; a mitokondriyal füzyon deneyi sırasında fotoaktivasyon sonra, PA-GFP sinyali Tipik seyreltme. A. PA-GFP tedricen selektör bu projeksiyon görüntü görülebilir olarak artan bir alanı üzerine proteinin seyreltme yol açan mitokondriyal füzyon olaylar yüzünden hale 6 optik bölümlerde her 15 dakikada bir miktarı ile. PA-GFP B. TMRE mitokondri depolarize aktif olmadığını göstermektedir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3991/3991fig2.jpg" /> . Mitokondrial füzyon 0.4 mM palmitat ile inhibe Şekil 2 PA-GFP seyreltilmesi azaltır. Zamanla değişmeyen bir sinyal yoğunluğu ile kısa mitokondri gösteren 6 optik bölümleri A. Projeksiyonları. TMRE PA-GFP B. kolokalizasyon mitokondrinin değildir gösterir dePolarize. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Braschi, E., McBride, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+the+culture+of+the+Borg:+understanding+the+integration+of+mitochondrial+function+within+the+reticulum,+the+cell,+and+the+organism.">Mitochondria and the culture of the Borg: understanding the integration of mitochondrial function within the reticulum, the cell, and the organism.</a> Bioessays. 32, 958-966 (2010).</li><li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+dynamic+organelles+in+disease,+aging,+and+development.">Mitochondria: dynamic organelles in disease, aging, and development.</a> Cell. 125, 1241-1252 (2006).</li><li>Chan, D. C., Detmer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics.">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).</li><li>Han, X. J., Tomizawa, K., Fujimura, A., Ohmori, I., Nishiki, T., Matsushita, M., Matsui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+dynamics+and+neurodegenerative+diseases.">Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases.</a> Acta Med Okayama. 65, 1-10 (2011).</li><li>Huang, H., Choi, S. Y., Frohman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+mitochondrial+fusion+using+Renilla+luciferase+complementation.">A quantitative assay for mitochondrial fusion using Renilla luciferase complementation.</a> Mitochondrion. 10, 559-566 (2010).</li><li>Karbowski, M., Arnoult, D., Chen, H., Chan, D. C., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+mitochondrial+dynamics+by+photolabeling+of+individual+organelles+shows+that+mitochondrial+fusion+is+blocked+during+the+Bax+activation+phase+of+apoptosis.">Quantitation of mitochondrial dynamics by photolabeling of individual organelles shows that mitochondrial fusion is blocked during the Bax activation phase of apoptosis.</a> J. Cell. Biol. 164, 493-499 (2004).</li><li>Legros, F., Lombes, A., Frachon, P., Rojo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+in+human+cells+is+efficient,+requires+the+inner+membrane+potential,+and+is+mediated+by+mitofusins.">Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofusins.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 4343-4354 (2002).</li><li>Molina, A. J., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+mitochondrial+dynamics+with+photoactivatable+[corrected]+green+fluorescent+protein.">Monitoring mitochondrial dynamics with photoactivatable [corrected] green fluorescent protein.</a> Methods Enzymol. 457, 289-304 (2009).</li><li>Molina, A. J., Wikstrom, J. D., Stiles, L., Las, G., Mohamed, H., Elorza, A., Walzer, G., Twig, G., Katz, S., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+networking+protects+beta-cells+from+nutrient-induced+apoptosis.">Mitochondrial networking protects beta-cells from nutrient-induced apoptosis.</a> Diabetes. 58, 2303-2315 (2009).</li><li>Otera, H., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+physiologic+functions+of+mitochondrial+dynamics.">Molecular mechanisms and physiologic functions of mitochondrial dynamics.</a> J. Biochem. 149, 241-251 (2011).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297, 1873-1877 (2002).</li><li>Schauss, A. C., Huang, H., Choi, S. Y., Xu, L., Soubeyrand, S., Bilodeau, P., Zunino, R., Rippstein, P., Frohman, M. A., McBride, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+mitochondrial+fusion+assay+amenable+for+high-throughput+screenings+of+fusion+modulators.">A novel cell-free mitochondrial fusion assay amenable for high-throughput screenings of fusion modulators.</a> BMC Biol. 8, 100 (2011).</li><li>Sheridan, C., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fission/fusion+dynamics+and+apoptosis.">Mitochondrial fission/fusion dynamics and apoptosis.</a> Mitochondrion. 10, 640-648 (2010).</li><li>Twig, G., Elorza, A., Molina, A. J., Mohamed, H., Wikstrom, J. D., Walzer, G., Stiles, L., Haigh, S. E., Katz, S., Las, G., Alroy, J., Wu, M., Py, B. F., Yuan, J., Deeney, J. T., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+and+selective+fusion+govern+mitochondrial+segregation+and+elimination+by+autophagy.">Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy.</a> EMBO J. 27, 433-446 (2008).</li><li>Twig, G., Graf, S. A., Wikstrom, J. D., Mohamed, H., Haigh, S. E., Elorza, A., Deutsch, M., Zurgil, N., Reynolds, N., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tagging+and+tracking+individual+networks+within+a+complex+mitochondrial+web+with+photoactivatable+GFP.">Tagging and tracking individual networks within a complex mitochondrial web with photoactivatable GFP.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C176-C184 (2006).</li><li>Twig, G., Hyde, B., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion,+fission+and+autophagy+as+a+quality+control+axis:+the+bioenergetic+view.">Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1777, 1092-1097 (2008).</li><li>Twig, G., Liu, X., Liesa, M., Wikstrom, J. D., Molina, A. J., Las, G., Yaniv, G., Hajnoczky, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+properties+of+mitochondrial+fusion+events+in+pancreatic+beta-cells+and+cardiac+cells+unravel+potential+control+mechanisms+of+its+selectivity.">Biophysical properties of mitochondrial fusion events in pancreatic beta-cells and cardiac cells unravel potential control mechanisms of its selectivity.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, C477-C487 (2010).</li><li>Twig, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+between+mitochondrial+dynamics+and+mitophagy.">The interplay between mitochondrial dynamics and mitophagy.</a> Antioxid. Redox Signal. 14, 1939-1951 (2011).</li></ol>

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Zeiss, Inc tarafından desteklenmektedir

Edinim fotoaktivasyon sonra her 15 dakikada oluşursa Bu yöntem, bir anda yaklaşık 10 hücre görüntüleme sağlar. Hücrelerin tam sayısı bir mtPAGFP ifade kültürü çanak içinde hücreleri, ve nasıl hızlı bir şekilde tüm yazılım parametrelerini bulmak ve işaretlemek mümkün olduğu kadar hızlı bağlıdır. Belirlenen z-yığın marjları tüm hücreler için geçerli olacak, çünkü otomasyon sorunsuz yapmak için hücrelerin bir tabaka kullanılmalıdır. Bu ilk fotoaktivasyon alanın büyüklüğü Denge süresi yönetecektir. Mitokondriyal füzyon ölçmek için edebilmek için, bu ağ geri kalanına sinyalinin zaman içinde yayılması izlenebilir olduğu gibi, ağ sadece% 10-20, photoactivate için önemlidir. Şebekenin çok photoactivated ise, tam bir füzyon çok hızlı gerçekleşirse olasıdır, ve olay ele alınmayacaktır. Extreme bakıma alınmalıiki-fotonlu lazer lazer güç aynı zamanda mitokondriyal depolarizasyonu yol açar fototoksisite önlemek için TMRE konsantrasyonu ayarlanır. MtPAGFP sinyal TMRE sinyali ile colocalizes sağlanması fototoksisite ve genel hücre sağlığı 8,15 değerlendirilmesinde yardımcı olabilir. Epifluoerescent ışık ile aydınlatma kaçınılmalıdır. MtPAGFP salgılayan hücrelerin ararken düşük güç 488nm uyarma ile tararken, iğne deliği maksimum açık olmalıdır. PA-1 saat boyunca GFP sinyali ölçmek için, ancak herhangi bir hücre 8 zor olabilir oversaturate için yeterli photoactivate için iki-fotonlu lazer güç ayarlanması. Bir kez otomatik program başlatılır Ancak, zaman bu optimizasyon adımda harcanması gerektiğini, bunun daha fazla hücre seçmek için, onu durdurmak ve devam ettirmek için sıkıcı bir iştir. Kalite kontrol için, diferansiyel müdahale kontrast (DIC) satın alma hücreleri üzerinde odak izlemek için görüntü (ya da iletilen ışık) çok olabiliryardımsever ve aynı zamanda tarama sırasında immersiyon yağı oluşan kabarcıklar algılamak için iyi bir yol, bu bazen sahne hareketlerinden olur. Bu yöntemi kullanarak mtPAGFP etiketlenmemiş olanlar için photoactivated mitokondriden mitokondriyal matriks protein hareketin tek yönlü verileri toplayan rağmen, diğer işlemler incelemek için bu teknik kullanmak için makuldür. Örneğin, özel florokromlar ABC-me, 15 çözünür matriks protein karıştırma farklı bir zaman ölçeği üzerinde oluştuğu bir füzyon için gösterildiği gibi, olayların füzyon sırasında belirli bir hareketini izlemek zar proteinleri eklenebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> COXIII-adenoviral PA-GFP </td><td> Dr Lippincott-Schwartz </td><td></td></tr><tr><td> TMRE </td><td> Invitrogen </td><td> T669 </td></tr><tr><td> Zeiss LSM 710 konfokal </td><td> Zeiss </td><td></td></tr></tbody></table>

a faster, high resolution, mtpa-gfp-based mitochondrial fusion assay acquiring kinetic data of multiple cells in parallel using confocal microscopy

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.
Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function18. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust14. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis9. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.
Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay7, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process 4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.
A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal6. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.
The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity8,15,16,17.
In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE8 in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO2, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Watch this Scientific Journal Video about A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy at JoVE.co

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

Mitokondriyal füzyon zamanla mitokondriyal ağ üzerinden photoconverted matris hedefli YFP dengelenme izleme ölçüldü. Şimdiye kadar, sadece bir hücre bir anda bir saat uzun kinetik analizine tabi olabilir. Biz aynı anda böylece veri toplama işlemini hızlandıracak, birden çok hücre ölçen bir yöntem sunuyoruz.

Paralel Konfokal Mikroskop kullanarak birden fazla Hücre Kinetik Veri Kazanılması A Daha hızlı, Yüksek Çözünürlük, MTPA-GFP tabanlı Mitokondrial Füzyon Deneyi

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Konfokal mikroskopi kullanılarak Yaşayan hücreler içinde endositik ve Sitosolik Bölümleri eşzamanlı pH Ölçümü

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Siteye Özgü DNA Bölünmesi için Paralel Yüksek İş Kinetik Test

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...