Name: nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy at JoVE.com

Vi takker Harald Hess og Eric Betzig for adgang til PALM mikroskop for proof-of-principle eksperimenter, Richard Fetter til deling fikseringspunkter protokoller, reagenser og opmuntring. Vi takker Michael Davidson, Geraldine Seydoux, Stefan Eimer, Rudolf Leube, Keith Nehrke, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema og Marc Hammarlund for DNA-konstruktioner. Vi takker også Carl Zeiss Inc. for at give adgang til Zeiss PAL-M, en betaversion af Zeiss Elyra P.1 PALM mikroskop.

<ol>
	<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers.">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. Neuroanat. 4, 24 (2010).</li><li>Bishop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+branding+efficiently+correlates+light+and+electron+microscopy.">Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).</li><li>Sims, P. A., Hardin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-integrated+transmission+electron+microscopy+images:+integrating+fluorescence+microscopy+with+transmission+electron+microscopy.">Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).</li><li>Micheva, K., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+method+for+cryofixation+and+correlative+light,+electron+microscopy+and+tomography+of+zebrafish+embryos.">A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos.</a> Traffic. 10, 131-136 (2009).</li><li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision.">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Weibull, C., Christiansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+proteins+and+membrane+lipids+during+low+temperature+embedding+of+biological+material+for+electron+microscopy.">Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy.</a> J. Microsc. 142, 79-86 (1986).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy.">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li><li>F lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates.">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nature Methods. 7, 717-719 (2010).</li><li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+background-free,+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+(SOFI).">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li><li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleaching/blinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules.">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li></ol>

Produktion og fri adgang til denne artikel er sponsoreret af Carl Zeiss, Inc.

Her beskriver vi, hvordan du bevarer fluorescerende proteiner i plast, de fluorescerende proteiner i sektioner lokalisere, og image ultrastrukturen hjælp elektronmikroskopi. Proteiner blev lokaliseret under diffraktionsgrænsen hjælp PALM mikroskopi til nanometer opløsning. For at tilpasse denne protokol til bestemte prøver, skal følgende parametre tages i betragtning: fluorofor, kvantificering og tilpasning. Valget af fluorescerende protein eller organiske fluorofor afhænger af anvendelsen og modelsystemet. Vi har testet en række fluorescerende proteiner, herunder EGFP, YFP, citrin, mEosFP, mEos2, tdEos, mOrange, PA-mCherry, og Dendra 12. Bevarelsen af ​​fluorescensen fra hver fluorofor var ens, hvilket antyder, at alle fluorescerende proteiner kan bevares ved hjælp af den beskrevne fremgangsmåde. Vi valgte tdEos fordi det udtrykkes godt i C. elegans, proteiner forblev funktionelle ved fusion til tdEos, og fordi densfoto-aktivering karakteristika var optimal for PALM mikroskopi. Imidlertid har aggregering eller undladt ekspression af tdEos er lejlighedsvis observeret 12. Afhængigt af programmet, kan en anden fluorofor være bedre egnet. I mange tilfælde er det ikke nødvendigt at anvende en foto-aktiverede fluorescerende protein. Simple korrelativ fluorescens elektronmikroskopi kræver ikke tilgængeligt aktiveret fluorescerende protein. GFP eller organiske farvestoffer kan anvendes til at afbilde fluorescens fra mærkede proteiner i afsnittene ovenfor diffraktionsgrænsen. For eksempel kan et billede en Axon i en neuropil ved hjælp af fluorescensmikroskopi og korrelere fluorescenssignal med en bestemt axon i et elektronmikrografi af afbilde fluorescens på et fluorescensmikroskop. Andre super-opløsning teknikker, såsom stimuleret emission udtømning mikroskopi (STED) 12, grundtilstand udtynding mikroskopi efterfulgt af individuel molekyle retur (GSDIM) 13, ogstruktureret lys-mikroskopi (SIM) 14 kræver ikke tilgængeligt-aktiverede fluorescerende proteiner. Desuden super-opløsning billeddannelse teknikker, der bruger organiske farvestoffer 9,15,16 eller den iboende egenskab af fluorescerende prober 17 er umiddelbart anvendelig. I PALM, kan antallet af molekyler kan kvantificeres, fordi fluorescensen af ​​hvert molekyle er adskilt rumligt og tidsligt. Dog kan kvantificering være vildledende for fire grunde: oxidation, undercounting, overcounting, og overekspression. For det første kan en brøkdel af de fluorescerende proteiner denatureres eller oxideres under prøvebearbejdning 5,12. Selv ~ 90% af fluorescenssignalet blev bevaret gennem fiksering og forankring i vores protokol, kan oxidation af det fluorescerende protein være efter at prøven har været i snit og overfladen udsættes for oxygen. Dels aktiveringen af ​​foto-aktiverbare proteiner er stokastisk, og dermed flere molekyler kan væreaktiveres i et givet diffraktion begrænset spot 8. Fluorescens fra de mange molekyler vil fremtræde som en plet, og dermed det samlede antal proteiner vil blive undercounted. For det tredje kan et lignende problem føre til overcounting. I PALM er hver fluorescerende protein lokaliseret og derefter &quot;slettes&quot; ved blegning. Dog kan fluorescerende proteiner vende tilbage fra den mørke tilstand uden at være permanent bleget 18. Sådanne molekyler vil derefter blive talt flere gange. Det fjerde mærkede proteiner er udtrykt som transgener og er ofte til stede i flere kopier, som kan føre til overekspression. Derfor kan kvantificering fra PALM bruges til at vurdere, men ikke nøjagtigt bestemme antallet af molekyler i en given lokalitet. Tilpasningen af ​​en PALM billede med et elektronmikrografi kan også være en udfordring på grund af opløsning forskel i lys-og elektronmikroskopi og forvrængning forårsaget af elektronstrålen. Guldpartikler anvendes som stramt localized referencemærker markører i elektronmikrofotografier. Men fluoresecence fra guldpartikler er ikke foto-aktiveret, og fremstår som en stor diffraktion-begrænset stedet. Således anbringelse af et fluorescens billede over et elektronmikrografi er et estimat. Forvridninger kan også opstå som følge af samspillet mellem elektroner med plast sektion. Acrylharpikser såsom GMA er mindre stabile under elektronstrålen, og dimensionerne af plastic kan ændres. Under disse omstændigheder kan tilpasse fluorescens med ultrastrukturen kræver ikke-lineær transformation af referencemærkerne markører.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset eller udstyr </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Højtryks-fryser </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> EMPact og HPM 100 fra Leica eller HPF-01 fra Wohlwend kan også anvendes. </td></tr><tr><td> Automatiseret fryse substitution enhed </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 kan også anvendes. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon og Vutara sælger også kommercielle PALM mikroskoper. </td></tr><tr><td> Scanningselektronmikroskop </td><td> FEI </td><td> Nova nano </td><td> Andre høj opløsning SEM mikroskoper kan anvendes. </td></tr><tr><td> Acetone </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osmium tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumpermanganat </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> Albumin fra okseserum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Uranylacetat </td><td> Polysciences </td><td> 21.447-25 </td><td> pH uranylacetat fra dette selskab er lidt højere. </td></tr><tr><td> Glycol methacrylat (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02.630-AA </td><td> Lavt syreindhold, TEM kvalitet. </td></tr><tr><td> N, N-dimethyl-p-toluidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo hætteglas </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Hætteglas </td><td> EMS </td><td> 72.632 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar film </td><td> EMS </td><td> 50.425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM kapsel </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Polypropylen </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DISC slag </td><td> Ted Pella </td><td> 54.741 </td><td></td></tr><tr><td> Nanopartikler af guld </td><td> mikrosfærer-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> Anmode 2x koncentreret opløsning </td></tr></tbody></table>

nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy

Kortlægning af fordelingen af ​​proteiner er væsentlige for forståelsen af ​​funktionen af ​​proteiner i en celle. Fluorescensmikroskopi benyttes flittigt til protein lokalisering, men subcellulær sammenhæng er ofte fraværende i fluorescens billeder. Immuno-elektronmikroskopi, på den anden side, lokalisere kan proteiner, men teknikken er begrænset af en mangel på kompatible antistoffer, dårlig bevarelse af morfologi og fordi de fleste antigener ikke udsættes for prøvens overflade. Korrelative fremgangsmåder kan opnå den fluorescens billede fra en helcelle først, enten fra immuno-fluorescens eller genetisk mærkede proteiner. Prøven bliver derefter fikseret og indlejret til elektronmikroskopi, og billederne er korrelerede 1-3. Imidlertid lav opløsning fluorescensbillede og manglen på referencemærker markører til hinder for nøjagtig lokalisering af proteiner. Alternativt kan fluorescensimagografi ske efter bevare prøven i plast. Idenne fremgangsmåde, blokken er opdelt, og fluorescensbilleder og Elektronmikrografier af den samme sektion er korreleret 4-7. Imidlertid diffraktionsgrænsen af ​​lys i det korrelerede billedet skjuler placeringen af ​​individuelle molekyler, og fluorescensen ofte strækker sig ud over grænsen for cellen. Nano-opløsning fluorescens elektronmikroskopi (nano-FEM) er designet til at lokalisere proteiner ved nano-skala af imaging de samme dele med foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM) og elektronmikroskopi. PALM overvinder diffraktionsgrænsen ved billeddannende enkelte fluorescerende proteiner og efterfølgende kortlægge centroiden af hver fluorescerende spot 8-10. Vi skitserer nano-FEM teknik i fem trin. Først bliver prøven fikseret og indlejret under anvendelse af betingelser, der bevarer fluorescens af mærkede proteiner. Dels harpiksen blokke er opdelt i ultratynde segmenter (70-80 nm), som er monteretpå et dækglas. For det tredje er fluorescens afbildet i disse afsnit ved hjælp af Zeiss PALM mikroskop. Det fjerde er elektrontætte strukturer afbildet i de samme sektioner ved hjælp af et scanningselektronmikroskop. Femte er de fluorescens og Elektronmikrografier opstillet under anvendelse guldpartikler som referencemærker markører. Sammenfattende kan den subcellulære lokalisering af fluorescens-mærkede proteiner bestemmes ved nanometer opløsning i cirka en uge.

Watch this Scientific Journal Video about Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy at JoVE.com

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Vi beskriver en fremgangsmåde til at lokalisere fluorescerende mærkede proteiner i elektronmikrofotografier. Fluorescens først lokaliseret ved brug af foto-aktiveret lokalisering mikroskopi på ultratynde sektioner. Disse billeder bliver derefter tilpasset elektronmikrografer af den samme sektion.

Nano-FEM: Protein Localization brug af foto-aktiverede Localization mikroskopi og elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Samtidig Multicolor Imaging af biologiske strukturer med Fluorescence Fotoaktivering Lokalisering Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Højtryks-Frysning og Quick Freeze Substitution af plantevævene for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Kvantificering af Protein Expression og Co-lokalisering Brug Multiplexed immunhistokemisk farvede og Multispektral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Tre-dimensionel Super Resolution Mikroskopi af F-actinfilamenter af Interferometrisk fotoaktiverede Lokalisering Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Multi-farve lokalisering mikroskopi af enkelt Membranproteiner i organeller af levende pattedyrceller

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske prøveforberedelse højtryks frysebehandling, mikrobølgeovn-assisteret kontrastforbedring og Minimal harpiks indlejring for volumen Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Visualisering af lymfeknude struktur og cellulær lokalisering ved hjælp af ex vivo-Konfokal mikroskopi

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

CryoAPEX-metoden til elektronmikroskopianalyse af membranproteinlokalisering i ultrastrukturelt bevarede celler

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Analyzing the ÃƒÅ½Ã‚Â±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Analyse af α-Actinin Network i Human iPSC-Afledte Kardiomyocytter ved hjælp af enkelt molekyle lokalisering mikroskopi

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Kryo-elektron mikroskopisk gitter forberedelse til tid-løste undersøgelser ved hjælp af en ny robot system, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...