Name: nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy at JoVE.com

Wij danken Harald Hess en Eric Betzig voor toegang tot de PALM microscoop voor proof-of-principle experimenten, Richard Fetter voor het delen van fixatie-protocollen, reagentia en bemoediging. Wij danken Michael Davidson, Geraldine Seydoux, Stefan Eimer, Rudolf Leuba, Keith Nehrke, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema en Marc Hammarlund voor DNA-constructen. We danken ook Carl Zeiss Inc voor de toegang tot de Zeiss PAL-M, een beta-versie van de Zeiss ELYRA P.1 PALM microscoop.

<ol>
	<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers.">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. Neuroanat. 4, 24 (2010).</li><li>Bishop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+branding+efficiently+correlates+light+and+electron+microscopy.">Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).</li><li>Sims, P. A., Hardin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-integrated+transmission+electron+microscopy+images:+integrating+fluorescence+microscopy+with+transmission+electron+microscopy.">Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).</li><li>Micheva, K., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+method+for+cryofixation+and+correlative+light,+electron+microscopy+and+tomography+of+zebrafish+embryos.">A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos.</a> Traffic. 10, 131-136 (2009).</li><li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision.">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Weibull, C., Christiansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+proteins+and+membrane+lipids+during+low+temperature+embedding+of+biological+material+for+electron+microscopy.">Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy.</a> J. Microsc. 142, 79-86 (1986).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy.">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li><li>F lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates.">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nature Methods. 7, 717-719 (2010).</li><li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+background-free,+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+(SOFI).">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li><li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleaching/blinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules.">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li></ol>

Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Carl Zeiss, Inc

Hier beschrijven we hoe u fluorescerende eiwitten te bewaren in plastic, lokaliseren de fluorescerende eiwitten in secties, en het imago van de ultrastructuur met behulp van elektronenmicroscopie. Eiwitten werden gelokaliseerd onder de diffractielimiet met behulp van PALM microscopie tot nanometer-resolutie. Om dit protocol aan te passen aan bepaalde exemplaren, moeten de volgende parameters worden overwogen: fluorofoor, kwantificering en uitlijning. De keuze van fluorescerend eiwit of organische fluorofoor afhankelijk van de toepassing en het modelsysteem. We hebben getest een verscheidenheid van fluorescerende eiwitten, met inbegrip van EGFP, YFP, Citrien, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA-mCherry en Dendra 12. Het behoud van fluorescentie van elk fluorofoor was vergelijkbaar, suggereert dat alle fluorescerende eiwitten kunnen worden bewaard volgens de beschreven werkwijze. We kozen tdEos omdat het goed uitgedrukt C. elegans, eiwitten bleven functioneel wanneer gefuseerd met tdEos, en omdat defotoactivering eigenschappen waren optimaal voor PALM microscopie. Echter, aggregatie of mislukte uitdrukking van tdEos is af en toe 12 waargenomen. Afhankelijk van de toepassing kan een andere fluorofoor beter geschikt. In veel gevallen is het niet nodig om een ​​foto-geactiveerde fluorescent eiwit te gebruiken. Eenvoudige correlatieve fluorescentie elektronenmicroscopie vereist geen foto-geactiveerde fluorescent eiwit. GFP of organische kleurstoffen kunnen worden gebruikt om beelden van fluorescentie-gemerkte eiwitten in de voorgaande hoofdstukken diffractiegrens. Bijvoorbeeld kan men een beeld axon in een neuropil gebruik van fluorescentiemicroscopie en correleren het fluorescentiesignaal met een bepaalde axon in een elektronenmicroscopische opname van de fluorescentie beeldvorming op een fluorescentiemicroscoop. Superresolutie andere technieken, zoals gestimuleerde emissie depletion microscopy (STED) 12 grondtoestand uitputting microscopie gevolgd door individuele molecule return (GSDIM) 13, engestructureerde verlichting microscopie (SIM) 14, vereisen geen foto-geactiveerde fluorescerende eiwitten. Bovendien superresolutie beeldvormingstechnieken die organische kleurstoffen 9,15,16 of de intrinsieke eigenschap van fluorescerende probes 17 worden toepasbaar zijn. In PALM, kan het aantal moleculen worden gekwantificeerd door fluorescentie van elk molecuul in ruimte en tijd gescheiden. Echter, kwantificering misleidend zijn om vier redenen: oxidatie, undercounting, overcounting, en overexpressie. Ten eerste kan een deel van de fluorescerende eiwitten worden gedenatureerd of geoxideerd tijdens monsterverwerking 5,12. Hoewel ~ 90% van het fluorescentiesignaal werd bewaard door fixatie en inbedding in ons protocol kan oxidatie van het fluorescerende eiwit later het monster is doorgesneden en het oppervlak blootgesteld aan zuurstof. Anderzijds de activering van foto-activeerbare eiwitten stochastisch en dus meerdere moleculen kan zijngeactiveerd in een gegeven diffractie beperkte plek 8. Fluorescentie van de meerdere moleculen verschijnt als een spot, en dus het totaal aantal eiwitten worden undercounted. Ten derde kan een soortgelijk probleem tot overcounting. In PALM, wordt elke fluorescerende eiwit gelokaliseerd en vervolgens op &quot;gewist&quot; door bleken. Echter, fluorescente eiwitten terug uit de donkere toestand, zonder permanent gebleekt 18. Dergelijke moleculen worden vervolgens meerdere keren geteld. Vierde gemerkte eiwitten worden uitgedrukt als transgenen en zijn vaak aanwezig in meerdere kopieën, wat kan leiden tot overexpressie. Daarom kan kwantificering van PALM worden gebruikt om te schatten maar niet nauwkeurig de aantal moleculen op een bepaalde locatie. De uitlijning van een PALM beeld met een elektronenmicrofoto ook een uitdaging omdat de resolutie verschil in licht-en elektronenmicroscopie en vervorming veroorzaakt door de elektronenbundel. Gouddeeltjes dienen als stevig localized de vaste markeringen in electronenmicroscoop. Echter fluoresecence van gouddeeltjes niet foto-geactiveerde, en weergegeven als een buigingsbegrensde vlek. Dus de plaatsing van een fluorescentiebeeld over een elektronenmicrofoto is een schatting. Verstoringen kunnen ook voortvloeien uit interacties van elektronen met het kunststof profiel. Acrylharsen zoals GMA minder stabiel onder de elektronenbundel en de afmetingen van de kunststof kan worden gewijzigd. Onder deze omstandigheden kan het uitlijnen van de fluorescentie met ultrastructuur vereisen niet-lineaire transformatie van de vaste markers.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum of uitrusting </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Hoge druk vriezer </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> Gehouden EMPACT en HPM 100 van Leica of hpf-01 van Wohlwend kunnen ook worden gebruikt. </td></tr><tr><td> Geautomatiseerde bevriezen substitutie-eenheid </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 kan ook worden gebruikt. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon en Vutara verkopen ook commerciële PALM microscopen. </td></tr><tr><td> Scanning elektronenmicroscoop </td><td> FEI </td><td> Nova nano </td><td> Andere hoge-resolutie SEM microscopen worden gebruikt. </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osmium tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumpermanganaat </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> Albumine uit runderserum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Uranylacetaat </td><td> Polysciences </td><td> 21.447-25 </td><td> pH van uranylacetaat van dit bedrijf is iets hoger. </td></tr><tr><td> Glycolmethacrylaat (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> Lage zuurgraad, TEM grade. </td></tr><tr><td> N, N-Dimethyl-p-toluidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryobuisjes </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Glazen flacons </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar film </td><td> EMS </td><td> 50.425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM capsule </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Polypropyleen </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DISC stoten </td><td> Ted Pella </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> Gouden nanodeeltjes </td><td> microsferen-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> Vraag 2x geconcentreerde oplossing </td></tr></tbody></table>

nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy

Kaart brengen van de verdeling van eiwitten is essentieel voor het begrijpen van de functie van eiwitten in een cel. Fluorescentie microscopie wordt veelvuldig gebruikt voor eiwit lokalisatie, maar subcellulaire is vaak afwezig in fluorescentie beelden. Immuno-elektron microscopie, anderzijds, kunnen lokaliseren eiwitten, maar de techniek is beperkt door een gebrek aan verenigbare antilichamen slecht behoud van de morfologie en omdat de meeste antigenen niet zijn blootgesteld aan het preparaatoppervlak. Correlatieve benaderingen kunnen verwerven van de fluorescentie beeld van een hele cel eerste, hetzij van immuno-fluorescentie of genetisch gemerkte eiwitten. Het monster wordt vervolgens gefixeerd en ingebed voor elektronenmicroscopie, en de beelden worden gecorreleerd 1-3. Echter, de lage resolutie fluorescentie beeld en het gebrek van de vaste markeringen de weg aan de precieze lokalisatie van eiwitten. Als alternatief kan fluorescentie beeldvorming worden gedaan na het behoud van het model in kunststof. Indeze benadering het blok is verdeeld, en fluorescentiebeelden en elektronenmicrofoto&#39;s van dezelfde sectie gecorreleerd 4-7. De diffractielimiet van licht in de overeenkomende afbeelding verbergt de locaties van individuele moleculen en de fluorescentie vaak uitstrekt voorbij de grens van de cel. Nano-resolutie fluorescentie elektronenmicroscopie (nano-FEM) is ontworpen voor het lokaliseren van eiwitten op nano-schaal door beeldvorming die zelfde delen met behulp van foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) en elektronenmicroscopie. PALM overwint de diffractiegrens door beeldvorming individuele fluorescerende eiwitten en vervolgens de kaart brengen zwaartepunt van elk fluorescerende vlek 8-10. We schetsen de nano-FEM techniek in vijf stappen. Eerst wordt het monster gefixeerd en ingebed onder omstandigheden die de fluorescentie van gelabelde eiwitten behouden. Anderzijds het hars blokken ultradunne coupes in segmenten (70-80 nm) die gemonteerdeen dekglas. Ten derde wordt de fluorescentie afgebeeld in deze gebieden af ​​met de Zeiss PALM microscoop. Ten vierde zijn electron dichte structuren afgebeeld in dezelfde profielen met een scanning elektronenmicroscoop. Vijfde, de fluorescentie en electronenmicroscoop uitgelijnd met gouddeeltjes als markers vertrouwenspunt. Samengevat kunnen de subcellulaire lokalisatie van fluorescent gemerkte eiwitten worden bepaald nanometerresolutie in ongeveer een week.

Watch this Scientific Journal Video about Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy at JoVE.com

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

We beschrijven een werkwijze voor het lokaliseren van fluorescent gemerkte eiwitten in electronenmicroscoop. Fluorescentie wordt eerst gelokaliseerd met foto-geactiveerde lokalisatie microscopie op ultradunne secties. Deze beelden worden dan uitgelijnd op elektronenmicrofoto&#39;s van dezelfde sectie.

Nano-Fem: Eiwit Localization Met behulp van foto-geactiveerde Localization Microscopie en Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Kwantificering van eiwitexpressie en Co-localisatie behulp multiplexverzending Immuno-histochemische kleuring en multispectrale

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Driedimensionale Super resolutie microscopie van de F-actine filamenten door interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Analyzing the ÃƒÅ½Ã‚Â±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Analyseren van de α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocyten Using Single Molecule Localization Microscopy

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Cryo-Elektron Microscopische Rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste studies met behulp van een nieuw robotsysteem, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...