Name: nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00
Duration: 13 min 13 s
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Nous tenons à remercier Harald Hess et Eric Betzig pour l&#39;accès au microscope PALM pour preuve de principe expériences, Richard Fetter pour les protocoles de partage de fixation, des réactifs et des encouragements. Nous remercions Michael Davidson, Geraldine Seydoux, Stefan Eimer, Rudolf Leube, Keith Nehrke, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema et Marc Hammarlund pour des constructions d&#39;ADN. Nous remercions également Carl Zeiss Inc pour fournir un accès à l&#39;Zeiss PAL-M, une version bêta du microscope Zeiss Elyra P.1 PALM.

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	<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers.">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. 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Microsc. 142, 79-86 (1986).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy.">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li><li>F lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates.">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nature Methods. 7, 717-719 (2010).</li><li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+background-free,+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+(SOFI).">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li><li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleaching/blinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules.">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li></ol>

Production et le libre accès à cet article est sponsorisé par Carl Zeiss, Inc

Nous décrivons ici comment préserver protéines fluorescentes en plastique, de localiser les protéines fluorescentes dans les sections, et l&#39;image de l&#39;ultrastructure en microscopie électronique. Les protéines ont été localisées en dessous de la limite de diffraction en microscopie PALM à résolution nanométrique. Pour adapter ce protocole aux spécimens particuliers, les paramètres suivants doivent être considérés: fluorophore, la quantification et l&#39;alignement. Le choix d&#39;une protéine fluorescente ou fluorophore organique dépend de l&#39;application et du système modèle. Nous avons testé une variété de protéines fluorescentes, y compris EGFP, YFP, Citrine, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA-mCherry et Dendra 12. La préservation de la fluorescence de chaque fluorophore était similaire, ce qui suggère que toutes les protéines fluorescentes peuvent être conservés à l&#39;aide de la méthode décrite. Nous avons choisi tdEos car il a bien exprimé dans C. elegans, les protéines demeurées fonctionnelles lorsqu&#39;il est fusionné à tdEos, et parce que sonphoto-activation caractéristiques sont optimales pour la microscopie PALM. Cependant, l&#39;expression d&#39;agrégation ou pas de tdEos a parfois été observée 12. Selon l&#39;application, un fluorophore différent peut-être mieux. Dans de nombreux cas, il n&#39;est pas nécessaire d&#39;utiliser une protéine fluorescente photo-activée. Simple microscopie électronique corrélative de fluorescence ne nécessite pas de photo-activé protéine fluorescente. GFP ou des colorants organiques peuvent être utilisés à fluorescence image à partir de protéines marquées dans les sections ci-dessus de la limite de diffraction. Par exemple, une boîte d&#39;image d&#39;un axone dans un neuropile en utilisant la microscopie par fluorescence et de corréler le signal de fluorescence d&#39;un axone particulier dans une micrographie électronique d&#39;imagerie par fluorescence sur l&#39;un microscope à fluorescence. D&#39;autres techniques de super-résolution, telles que la microscopie d&#39;émission stimulée épuisement (STED) 12, la microscopie appauvrissement de l&#39;état fondamental suivi par le retour molécule individuelle (GSDIM) 13, etmicroscopie illumination structurée (SIM) 14, n&#39;ont pas besoin de photo-activés protéines fluorescentes. En outre, de super-résolution des techniques d&#39;imagerie utilisant des colorants organiques 9,15,16 ou la propriété intrinsèque des sondes fluorescentes 17 sont facilement applicables. Dans PALM, le nombre de molécules peuvent être quantifiés en raison de fluorescence de chaque molécule est séparé spatialement et temporellement. Cependant, la quantification peut être trompeuse pour quatre raisons: oxydation, sous-estimation, surdénombrement, et la surexpression. Tout d&#39;abord, une fraction des protéines fluorescentes peuvent être dénaturé ou oxydée pendant le traitement d&#39;échantillons 5,12. Bien que ~ 90% du signal de fluorescence a été préservée grâce à la fixation et l&#39;inclusion dans notre protocole, l&#39;oxydation de la protéine fluorescente peut se produire après que l&#39;échantillon a été sectionné et la surface exposée à l&#39;oxygène. D&#39;autre part, l&#39;activation des protéines photo-activables est stochastique, et ainsi de multiples molécules peuvent êtreactivés dans une tache de diffraction donnée limitée 8. Fluorescence des molécules multiples apparaîtra comme une tache, et donc le nombre total de protéines vont être sous-estimés. Troisièmement, un problème similaire peut conduire à surdénombrement. Dans PALM, chaque protéine fluorescente est localisée puis «effacées» par le blanchiment. Toutefois, les protéines fluorescentes peut revenir de l&#39;état sombre sans être définitivement blanchi 18. Ces molécules seront ensuite comptée plusieurs fois. Quatrièmement, les protéines marquées sont exprimés en transgènes et sont souvent présents en plusieurs exemplaires, ce qui peut conduire à une surexpression. Par conséquent, la quantification de PALM peut être utilisée pour estimer, mais pas de déterminer avec précision le nombre de molécules dans un lieu donné. L&#39;alignement d&#39;une image PALM avec une micrographie électronique peut aussi être difficile à cause de la différence de résolution en microscopie optique et électronique et la distorsion provoquée par le faisceau d&#39;électrons. Les particules d&#39;or servent bien loclisés marqueurs repères dans micrographies électroniques. Cependant, fluoresecence de particules d&#39;or n&#39;est pas photo-activé, et apparaît comme une grande tache limitée par la diffraction. Ainsi, la mise en place d&#39;une image de fluorescence sur une micrographie électronique est une estimation. Distorsions peuvent également survenir des interactions des électrons avec la partie plastique. Résines acryliques tels que les GMA sont moins stables sous le faisceau d&#39;électrons, et les dimensions de la matière plastique peut être modifié. Dans ces circonstances, l&#39;alignement de la fluorescence avec ultrastructure peut exiger une transformation non linéaire des marqueurs fiduciaires.

<table border="1"><tbody><tr><td> Le nom du réactif ou de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Haute pression congélateur </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> EMPACT et HPM 100 de Leica ou hpf-01 de Wohlwend peut également être utilisé. </td></tr><tr><td> Automatisé unité cryosubstitution </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 peut également être utilisé. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon et Vutara vendent aussi des microscopes PALM commerciales. </td></tr><tr><td> Microscope électronique à balayage </td><td> FEI </td><td> Nouvelle nano </td><td> D&#39;autres haute résolution des microscopes MEB peuvent être utilisées. </td></tr><tr><td> Acétone </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osmium tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> Le permanganate de potassium </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;albumine de sérum bovin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acétate d&#39;uranyle </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> pH de l&#39;acétate d&#39;uranyle de cette compagnie est légèrement plus élevé. </td></tr><tr><td> Méthacrylate (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> Acide faible, la qualité du TEM. </td></tr><tr><td> N, N-diméthyl-p-toluidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes Cryo </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Flacons en verre </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> Film de Aclar </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM capsule </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Polypropylène </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DISC poinçons </td><td> Ted Pella </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> Les nanoparticules d&#39;or </td><td> microsphères-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> Demander 2x solution concentrée </td></tr></tbody></table>

nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy

Cartographie de la répartition des protéines est essentielle pour comprendre la fonction des protéines dans une cellule. La microscopie à fluorescence est largement utilisé pour la localisation des protéines, mais le contexte subcellulaire est souvent absent dans les images de fluorescence. Immuno-microscopie électronique, d&#39;autre part, peuvent localiser les protéines, mais la technique est limitée par un manque d&#39;anticorps compatibles, la préservation de la morphologie des pauvres et parce que la plupart des antigènes sont pas exposés à la surface de l&#39;échantillon. Approches corrélatives peuvent acquérir l&#39;image de fluorescence d&#39;une cellule toute la première, soit à partir de l&#39;immuno-fluorescence ou de protéines génétiquement marqués. L&#39;échantillon est ensuite fixé et intégré pour la microscopie électronique, et les images sont corrélées 1-3. Cependant, l&#39;image basse résolution fluorescence et le manque de marqueurs fiduciaires obstacle à la localisation précise des protéines. Alternativement, l&#39;imagerie de fluorescence peut être fait après préservant l&#39;échantillon dans du plastique. Encette approche, le bloc est sectionné, et les images de fluorescence et micrographies électroniques de la même section sont corrélées 4-7. Cependant, la limite de diffraction de la lumière dans l&#39;image corrélé obscurcit les emplacements des molécules individuelles, et la fluorescence s&#39;étend souvent au-delà de la limite de la cellule. Nano-résolution de fluorescence par microscopie électronique (nano-FEM) est conçu pour localiser les protéines à l&#39;échelle nanométrique par imagerie les mêmes sections en utilisant la microscopie localisation photo-activé (PALM) et la microscopie électronique. PALM surmonte la limite de diffraction individuels d&#39;imagerie par fluorescence des protéines et ensuite la cartographie du centroïde de chaque tache fluorescente 8-10. Nous décrivons la technique de nano-FEM en cinq étapes. Tout d&#39;abord, l&#39;échantillon est fixe et intégrée en utilisant des conditions qui préservent la fluorescence des protéines marquées. D&#39;autre part, les blocs de résine sont coupés en segments ultraminces (70-80 nm) qui sont montéssur un verre de recouvrement. Troisièmement, la fluorescence est représenté dans ces sections en utilisant le microscope Zeiss PALM. Quatrièmement, électrons structures denses sont imagés dans ces mêmes articles à l&#39;aide d&#39;un microscope électronique à balayage. Cinquièmement, les micrographies de fluorescence et électronique sont alignées en utilisant des particules d&#39;or comme marqueurs fiduciaires. En résumé, la localisation subcellulaire des protéines marquées par fluorescence peut être déterminée à une résolution nanométrique dans environ une semaine.

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Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nous décrivons une méthode pour localiser les protéines marquées par fluorescence en microscopie électronique. Fluorescence est d&#39;abord localisée en utilisant la microscopie localisation photo-activé sur coupes ultrafines. Ces images sont ensuite alignées à micrographies électroniques de la même section.

Nano-FEM: la localisation des protéines en utilisant la microscopie Localisation Photo-actif et microscopie électronique

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