Name: nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00
Duration: 13 min 13 s
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Ringraziamo Harald Hess e Eric Betzig per l&#39;accesso al microscopio PALM per prova di principio esperimenti, Richard Fetter per la condivisione di protocolli di fissaggio, reagenti e incoraggiamento. Ringraziamo Michael Davidson, Geraldine Seydoux, Stefan Eimer, Rudolf Leube, Keith Nehrke, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema e Marc Hammarlund per costrutti di DNA. Ringraziamo anche Carl Zeiss Inc. per fornire l&#39;accesso alla Zeiss PAL-M, una versione beta del microscopio Zeiss ELYRA P.1 PALM.

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. 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Produzione e l&#39;accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Carl Zeiss, Inc.

Qui si descrive come conservare proteine ​​fluorescenti in plastica, localizzare le proteine ​​fluorescenti nelle sezioni, e l&#39;immagine della ultrastruttura usando la microscopia elettronica. Le proteine ​​sono state localizzate al di sotto del limite di diffrazione con il microscopio a PALM a risoluzione nanometrica. Per adattare questo protocollo ad esemplari particolari, i seguenti parametri devono essere considerati: fluoroforo, quantificazione, e l&#39;allineamento. La scelta della proteina fluorescente o fluoroforo organico dipende dall&#39;applicazione e il sistema modello. Abbiamo testato una varietà di proteine ​​fluorescenti, tra cui EGFP, YFP, Citrino, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA-mCherry e Dendra 12. La conservazione di fluorescenza da ciascun fluoroforo era simile, suggerendo che tutte le proteine ​​fluorescenti possono essere conservate con il metodo descritto. Abbiamo scelto tdEos perché esprime bene in C. elegans, proteine ​​è rimasto funzionale quando fusa tdEos, e perché la suafoto-attivazione caratteristiche erano ottimali per microscopia PALM. Tuttavia, l&#39;espressione non di aggregazione o tdEos è stata occasionalmente osservata 12. A seconda dell&#39;applicazione, un fluoroforo diverso può essere più adatto. In molti casi, non è necessario utilizzare una foto-activated proteina fluorescente. Semplice microscopia elettronica correlativa fluorescenza non richiede foto-activated proteina fluorescente. GFP o coloranti organici possono essere utilizzati per fluorescenza immagine da proteine ​​marcate in sezioni sopra il limite di diffrazione. Ad esempio, uno può immagine assone in un neuropilo utilizzando microscopia a fluorescenza e correlare il segnale di fluorescenza con un assone particolare in una micrografia elettronica da imaging la fluorescenza su un microscopio a fluorescenza. Altri super-risoluzione di tecniche, come la microscopia emissione stimolata esaurimento (STED) 12, stato di microscopia terra esaurimento seguita dal ritorno singola molecola (GSDIM) 13, emicroscopia illuminazione strutturata (SIM) 14, non necessitano di proteine ​​fluorescenti foto-attivati. Inoltre, super-risoluzione di tecniche di imaging che utilizzano coloranti organici 9,15,16 o la proprietà intrinseca di sonde fluorescenti 17 sono facilmente applicabili. In PALM, il numero di molecole può essere quantificata per fluorescenza di ogni molecola è separata spazialmente e temporalmente. Tuttavia, la quantificazione può essere fuorviante per quattro ragioni: ossidazione, sottostima, overcounting e sovraespressione. Primo, una frazione delle proteine ​​fluorescenti possono essere denaturato o ossidato durante l&#39;elaborazione del campione 5,12. Sebbene ~ 90% del segnale di fluorescenza è stata conservata attraverso fissazione e nell&#39;inclusione nel nostro protocollo, l&#39;ossidazione della proteina fluorescente può verificarsi dopo che il campione è stato sezionato e la superficie esposta all&#39;ossigeno. Secondo, l&#39;attivazione di foto-attivabili proteine ​​è stocastico, e quindi molecole multiple possono essereattivato in un luogo determinato diffrazione limitata 8. Fluorescenza dalle molecole multiple apparirà come un punto, e quindi il numero totale di proteine ​​verrà sottostimato. In terzo luogo, un problema simile può portare a overcounting. In PALM, ogni proteina fluorescente è localizzato e poi &quot;cancellato&quot; da sbiancamento. Tuttavia, le proteine ​​fluorescenti può tornare dallo stato buio senza essere sbiancato in modo permanente 18. Tali molecole saranno quindi contati più volte. Quarto, proteine ​​marcate sono espressi come transgeni e sono spesso presenti in più copie, che può portare a sovraespressione. Pertanto, quantificazione da PALM può essere usato per stimare ma non precisamente determinare il numero di molecole in una data posizione. L&#39;allineamento di un&#39;immagine PALM con un microscopio elettronico può essere difficile a causa della differenza risoluzione in microscopia ottica ed elettronica e la distorsione causata dal fascio di elettroni. Particelle d&#39;oro servono come strettamente localized marcatori di riferimento nel microscopio elettronico. Tuttavia, fluoresecence da particelle d&#39;oro non è foto-attivato, e si presenta come un grande diffrazione limitata spot. Pertanto, il posizionamento di una immagine di fluorescenza su un microscopio elettronico è una stima. Le distorsioni possono anche derivare da interazioni degli elettroni con la sezione di plastica. Resine acriliche GMA sono meno stabili sotto il fascio di elettroni, e le dimensioni della plastica può essere alterato. In queste circostanze, allineando la fluorescenza con ultrastruttura può richiedere trasformazione non lineare dei marker fiduciali.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente o attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Alta pressione freezer </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> EMPact e HPM 100 da Leica o HPF-01 da Wohlwend può anche essere usato. </td></tr><tr><td> Automatizzato congelamento unità sostituzione </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 può anche essere usato. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon e Vutara vendono anche microscopi PALM commerciali. </td></tr><tr><td> Microscopio elettronico a scansione </td><td> FEI </td><td> Nova nano </td><td> Altre alta risoluzione microscopi SEM può essere utilizzato. </td></tr><tr><td> Acetone </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459.844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osmio tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> Permanganato di potassio </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina da siero bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Acetato di uranile </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> pH di acetato di uranile da questa società è leggermente superiore. </td></tr><tr><td> Glicole metacrilato (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> Acido basso, grado TEM. </td></tr><tr><td> N, N-dimetil-p-toluidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo fiale </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Fiale di vetro </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar pellicola </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM capsula </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Polipropilene </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DISC pugni </td><td> Ted Pella </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> Nanoparticelle d&#39;oro </td><td> microsfere-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> Richiedi 2x soluzione concentrata </td></tr></tbody></table>

nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy

Mappatura della distribuzione delle proteine ​​è essenziale per la comprensione della funzione delle proteine ​​in una cellula. Microscopia a fluorescenza è ampiamente utilizzato per la localizzazione delle proteine, ma il contesto subcellulare è spesso assente nelle immagini di fluorescenza. Immuno-microscopia elettronica, invece, può localizzare le proteine, ma la tecnica è limitata dalla mancanza di anticorpi compatibili, cattiva conservazione della morfologia e perché la maggior parte degli antigeni non sono esposti alla superficie del campione. Approcci correlativi in ​​grado di acquisire l&#39;immagine di fluorescenza da una cella tutta la prima, sia da immuno-fluorescenza o proteine ​​geneticamente marcate. Il campione viene poi fissate e incorporato per microscopia elettronica, e le immagini sono correlati 1-3. Tuttavia, l&#39;immagine a bassa risoluzione fluorescenza e la mancanza di marker fiduciali preclude la localizzazione precisa di proteine. In alternativa, l&#39;imaging di fluorescenza può essere fatta dopo preservare il campione in plastica. Inquesto approccio, il blocco viene sezionato, e immagini di fluorescenza e micrografie elettroniche della stessa sezione sono correlati 4-7. Tuttavia, il limite di diffrazione della luce dell&#39;immagine correlata oscura le posizioni delle singole molecole, e la fluorescenza estende spesso oltre il confine della cella. Nano-risoluzione fluorescenza microscopia elettronica (nano-FEM) è stato progettato per localizzare proteine ​​al nano-scala di imaging le stesse sezioni con foto-attivato microscopia localizzazione (PALM) e microscopia elettronica. PALM supera il limite di diffrazione di immagini singole proteine ​​fluorescenti e, successivamente, la mappatura del baricentro di ogni 8-10 spot fluorescente. Si delineano il nano-FEM tecnica in cinque fasi. Primo, il campione è fisso e incorporato utilizzando condizioni che preservano la fluorescenza di proteine ​​marcate. Secondo, i blocchi di resina sono sezionate in segmenti ultrasottili (70-80 nm) che sono montatisu un vetro di copertura. In terzo luogo, la fluorescenza è ripreso in queste sezioni utilizzando il microscopio PALM Zeiss. Quarto, elettroni strutture dense vengono esposte in queste sezioni stesse utilizzando un microscopio elettronico a scansione. In quinto luogo, le micrografie fluorescenza ed elettronica sono allineati con particelle d&#39;oro come marker fiduciali. In sintesi, la localizzazione subcellulare di proteine ​​fluorescenti con etichetta può essere determinato a risoluzione nanometrica in circa una settimana.

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Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Descriviamo un metodo per localizzare fluorescente proteine ​​marcate nel microscopio elettronico. Fluorescenza viene prima localizzato con foto-attivato microscopia localizzazione su sezioni ultrasottili. Queste immagini vengono quindi allineati al microscopio elettronico della stessa sezione.

Nano-Fem: la localizzazione delle proteine ​​Usando Photo-attivato Microscopia Localizzazione e microscopia elettronica

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