Name: nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00
Duration: 13 min 13 s
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우리는 증명 원리 실험, 고정 프로토콜 시약과 격려를 공유 리차드 족쇄를 채우다을위한 PALM 현미경에 대한 접근 랄드 헤스와 에릭 Betzig 감사드립니다. 우리는 DNA 구조에 대한 마이클 데이비슨, 제랄딘 Seydoux, 스테판 Eimer, 루돌프 Leube, 키이스 Nehrke, 기독교 Frøk​​jr - 젠슨, 오드 에이다 - Nguema과 마크 Hammarlund 감사드립니다. 우리는 또한 Zeiss PAL-M, Zeiss Elyra P.1 PALM 현미경의 베타 버전에 대한 액세스를 제공하기 위해 칼 Zeiss 주식회사 감사드립니다.

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	<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers.">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. 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이 기사에 생산 및 무료 액세스 칼 Zeiss 주식회사가 후원합니다

여기 플라스틱, 전자 현미경을 사용하여 ultrastructure을 섹션에 형광 단백질을 현지화 및 이미지 형광 단백질을 유지하는 방법에 대해 설명합니다. 단백질은 나노 미터 해상도 PALM 현미경을 사용하여 회절 한계 이하로 현지화되었습니다. 특정 표본이 프로토콜을 적응하려면 다음 매개 변수 고려되어야합니다 : 형광, 정량화 및 정렬을. 형광 단백질 또는 유기 형광의 선택은 응용 프로그램 및 모델 시스템에 따라 달라집니다. 우리는 EGFP, YFP, 황수정, mEosFP, mEos2, tdEos, mOrange, PA-mCherry, 그리고 Dendra 12 등의 형광 단백질의 다양한, 테스트했습니다. 각 형광의 형광의 보존은 형광 단백질은 설명 방법을 사용하여 보존 할 수 있다는 제안, 비슷했다. 이 표현 때문에 우리는 C.에 잘 tdEos를 선택 elegans, 단백질은 tdEos에 융합 할 때 기능 유지, 그리고 또 다른 이유는 그사진 인증 특성은 PALM 현미경을위한 최적했다. 그러나, tdEos의 집합 또는 실패 표현식은 경우에 따라 12 관찰되었습니다. 응용 프로그램에 따라 다른 형광 더 적합한 수 있습니다. 대부분의 경우, 그것은 사진 활성 형광 단백질을 사용할 필요가 없습니다. 간단한 상호 형광 전자 현미경은 사진 활성 형광 단백질을 필요로하지 않습니다. GFP 또는 유기 염료는 회절 한도를 초과 섹션에 태그를 단백질에서 이미지 형광에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 이미지를 형광 현미경을 사용하여 neuropil의 축삭 및 이미징에 의한 전자 현미경에서 특정 축삭 형광 현미경에 형광과 형광 신호를 상관 관계 할 수 있습니다. 이러한 자극 방출 고갈 현미경 (전혀 두려움을 모르는 강인한) 12, 개별 분자 수익 (GSDIM) 13 다음 바닥 상태의 고갈 현미경과 같은 다른 슈퍼 해상도 기술,구조적 조명 현미경 (SIM) 14 사진 활성 형광 단백질이 필요하지 않습니다. 또한, 유기 염료 9,15,16 또는 형광 프로브 17 본질적인 속성을 사용 슈퍼 해상도 이미징 기술은 쉽게 적용 할 수 있습니다. 각 분자의 형광이 spatially과 시간적으로 분리되어 있기 때문에 PALM에서 분자의 수는 정량화 할 수 있습니다. 산화, undercounting, overcounting 및 overexpression : 그러나, 정량화 네 이유로 오해의 소지가있을 수 있습니다. 첫째, 형광 단백질의 일부가 변성 또는 샘플 처리 5,12 동안 산화 할 수 있습니다. 형광 신호의 ~ 90 %가 우리의 프로토콜에 고정하고 삽입을 통해 보존되었지만 표본이 sectioned되었으며 표면이 산소에 노출 후, 형광 단백질의 산화가 발생할 수 있습니다. 둘째, 사진 activatable 단백질의 활성화 확률이며, 따라서 여러 분자가 될 수 있습니다주어진 회절 제한된 장소 8 활성화. 여러 분자의 형광은 한 점으로 표시됩니다, 따라서 단백질의 총 수는 undercounted됩니다. 셋째, 비슷한 문제가 overcounting 될 수 있습니다. PALM에서 표백하여 각 형광 단백질은 지역화되어 있으며 다음 &quot;삭제&quot;. 그러나, 형광 단백질은 18 영구적으로 표백 않고 어두운 상태에서 돌아갈 수 있습니다. 이러한 분자 그런 다음 여러 번 계산 될 것입니다. 넷째, 태그 단백질은 transgenes으로 표현하고 자주 overexpression 될 수 있습니다 여러 복사본에 제시되어 있습니다. 따라서, PALM의 정량화는 지정된 위치에 분자의 수를 추정하지만, 정확하게 확인할 수 없습니다하는 데 사용할 수 있습니다. 전자 현미경과 PALM 이미지의 정렬은 또한 때문에 전자빔에 의한 빛과 전자 현미경과 왜곡의 해상도 차이에 도전 할 수 있습니다. 골드 입자는 단단히 LOC 제공전자 micrographs의 fiducial 마커를 alized. 그러나, 금 입자의 fluoresecence이 사진 활성화되어 있지 않습니다, 대형 회절 - 제한된 곳으로 나타납니다. 따라서, 전자 현미경을 통해 형광 이미지의 게재 위치는 추정치입니다. 왜곡은 또한 플라스틱 섹션 전자의 상호 작용에서 발생할 수 있습니다. 같은 GMA와 같은 아크릴 수지는 전자빔에 따라 덜 안정적이며, 플라스틱의 크기가 변경 될 수 있습니다. 이러한 상황에서 ultrastructure으로 형광을 정렬하면 fiducial 마커의 비 선형 변환이 필요할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 또는 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 고압 냉동기 </td><td> 상자를 </td><td> HPM 010 </td><td> EMPact과 Wohlwend에서 Leica 또는 hpf-01에서 HPM (100)는도 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 자동 동결 대체 단위 </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1도 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> 니콘과 Vutara 또한 상업적 PALM의 현미경을 판매하고 있습니다. </td></tr><tr><td> 전자 현미경 </td><td> 페이 </td><td> 노바 나노 </td><td> 기타 고해상도 SEM의 현미경을 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 아세톤 </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td> 오스뮴 tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> 칼륨 과망간산 염 </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민의 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Uranyl 아세테이트 </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> 이 회사의 uranyl 아세트산의 pH는 약간 높다. </td></tr><tr><td> 글리콜 메타 크릴 레이트 (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> 낮은 산, TEM 등급. </td></tr><tr><td> N, N-디메틸-P-toluidine </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo 튜브 </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 병 </td><td> EMS </td><td> 72,632 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar 필름 </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM 캡슐 </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> 폴리 프로필렌 </td></tr><tr><td> 3 / 8 &quot;디스크 펀치 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 54,741 </td><td></td></tr><tr><td> 골드 나노 입자 </td><td> 마이크로 - nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> 2 배 농축 솔루션을 요청 </td></tr></tbody></table>

nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy

단백질의 분포를 매핑하면 셀에 단백질의 기능을 이해하는 것이 필수적입니다. 형광 현미경은 광범위하게 단백질 현지화에 사용하지만, subcellular 문맥 형광 이미지에 자주 결석입니다. Immuno-전자 현미경은 반면에, 단백질을 지역화 할 수 있지만, 대부분의 항원이 표본 표면에 노출되지 않기 때문에 기술은 호환 항체, 형태와 가난한 보존의 부족에 의해 제한됩니다. 상호 접근 방식 중 하나 immuno-형광이나 유전자 태그 단백질, 먼저 전체 셀에서 형광 이미지를 취득 할 수 있습니다. 예제는 다음 고정 및 전자 현미경에 내장하고, 이미지가 1-3 상관이됩니다. 그러나, 낮은 해상도 형광 이미지와 fiducial 마커의 부족은 단백질의 정확한 현지화를 배제. 또한, 형광 이미징은 플라스틱의 표본을 보존 한 후에 수행 할 수 있습니다. 에이 방법은 블록 sectioned이며, 형광 이미지와 동일한 섹션의 전자 micrographs는 4-7를 서로 관련되어 있습니다. 그러나, 상관 이미지에 빛의 회절 한계는 개별 분자의 위치를​​ 가린다하고, 형광은 종종 세포의 경계 넘어 확장합니다. 나노 해상도 형광 전자 현미경 (나노 FEM)이 사진 활성 현지화 현미경 (PALM)과 전자 현미경을 사용하여 이미징 같은 섹션으로 나노 스케일의 단백질을 현지화하기 위해 설계되었습니다. PALM는 영상 개인 형광 단백질에 의해 회절 한계를 극복하고 이후 각 형광 현장 8-10의 중심을 매핑. 우리는 다섯 단계에있는 나노 FEM 기술을 설명합니다. 먼저, 예제는 고정 및 태그 단백질의 형광을 보존 조건을 사용하여 포함하고 있습니다. 둘째, 수지 블록 장착 ultrathin 세그먼트 (70-80 nm 정도)에 sectioned 아르커버 유리에. 셋째, 형광은 Zeiss의 PALM 현미경을 사용하여 이러한 섹션에 이미징된다. 넷째, 전자 고밀도 구조는 스캔 전자 현미경을 사용하여 이러한 동일한 섹션에 이미징 있습니다. 다섯째, 형광 및 전자 micrographs는 fiducial 마커 등의 금 입자를 사용하여 정렬된다. 요약하면, 휘황 태그 단백질의 subcellular 지방화는 약 1 주일 나노 미터 해상도로 결정될 수있다.

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Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

우리는 전자 micrographs에 휘황 태그 단백질을 지역화하는 방법을 설명합니다. 형광 먼저 ultrathin 섹션에 사진 활성 현지화 현미경을 사용하여 지역화되어 있습니다. 이러한 이미지는 다음 같은 섹션의 전자 micrographs으로 정렬되어 있습니다.

나노 FEM : 사진 활성화 된 현지화 현미경과 전자 현미경을 사용하여 단백질 현지화

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