Name: nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00
Duration: 13 min 13 s
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Agradecemos Harald Hess e Eric Betzig para o acesso ao microscópio PALM para a prova de princípio experimentos, Richard Fetter para a partilha de protocolos de fixação, reagentes e encorajamento. Agradecemos Michael Davidson, Geraldine Seydoux, Stefan Eimer, Rudolf Leube, Keith Nehrke, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema e Marc Hammarlund para construções de DNA. Agradecemos também a Carl Zeiss Inc. para fornecer acesso à Zeiss PAL-M, uma versão beta do P.1 Elyra microscópio Zeiss PALM.

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	<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers.">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates.">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nature Methods. 7, 717-719 (2010).</li><li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+background-free,+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+(SOFI).">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li><li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleaching/blinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules.">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li></ol>

Produção e livre acesso a este artigo é patrocinado pela Carl Zeiss, Inc.

Aqui descrevemos como preservar proteínas fluorescentes em plástico, localizar as proteínas fluorescentes nas seções, ea imagem do ultra-estrutura por microscopia eletrônica. Proteínas foram localizadas abaixo do limite de difração usando microscopia PALM para resolução de nanômetros. Para adaptar este protocolo para espécimes específicos, os seguintes parâmetros devem ser considerados: fluoróforo, quantificação e alinhamento. A escolha de uma proteína fluorescente ou fluoróforo orgânico depende da aplicação e o sistema de modelo. Temos testado numa variedade de proteínas fluorescentes, incluindo GFP, YFP, citrino, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA-mCherry e Dendra 12. A preservação da fluorescência de cada fluoróforo foram semelhantes, sugerindo que todas as proteínas fluorescentes podem ser preservados utilizando o método descrito. Escolhemos tdEos porque expressa bem em C. elegans, as proteínas se funcional, quando fundido a tdEos, e porque a suafoto-ativação características foram ideal para microscopia PALM. No entanto, a agregação ou não expressão de tdEos foi ocasionalmente observado 12. Dependendo da aplicação, um fluoróforo diferente, pode ser mais adequado. Em muitos casos, não é necessária a utilização de uma proteína de foto-activado fluorescente. Simples correlativo microscopia electrónica de fluorescência não requer foto-activado de proteína fluorescente. GFP ou corantes orgânicos podem ser utilizados para imagem de fluorescência de proteínas marcadas em secções acima do limite de difracção. Por exemplo, pode-se axon uma imagem num neuropil usando microscopia de fluorescência e correlacionar o sinal de fluorescência com um axónio particular em uma micrografia electrónica por imagiologia de fluorescência num microscópio de fluorescência. Outras técnicas de super-resolução, tais como microscopia de emissão estimulada esgotamento (STED) 12, chão de microscopia de depleção estado seguido de retorno molécula individual (GSDIM) 13, emicroscopia de iluminação estruturada (SIM) 14, não precisam de foto-activados proteínas fluorescentes. Além disso, as técnicas de super-resolução de imagem que utilizam corantes orgânicos 9,15,16 ou a propriedade intrínseca de sondas fluorescentes 17 são facilmente aplicáveis. Em PALM, o número de moléculas pode ser quantificada por fluorescência de cada molécula está separado espacialmente e temporalmente. No entanto, a quantificação pode ser enganosa por quatro motivos: oxidação, subestimação, overcounting e superexpressão. Em primeiro lugar, uma fracção das proteínas fluorescentes pode ser desnaturado ou oxidados durante o processamento da amostra 5,12. Embora ~ 90% do sinal de fluorescência foi preservada por meio da fixação e incorporação no nosso protocolo, a oxidação da proteína fluorescente pode ocorrer depois de o espécime foi seccionado e a superfície exposta ao oxigénio. Em segundo lugar, a activação do foto-activáveis ​​proteínas é estocástico, e, assim, as moléculas podem ser múltiplasativado em um ponto de difração dada limitada 8. Fluorescência das moléculas múltiplas mesma aparece como uma mancha, e, assim, o número total de proteínas será contado regressivamente. Em terceiro lugar, um problema semelhante pode levar a overcounting. Na palma, cada proteína fluorescente é localizado e então &quot;apagados&quot; pelo branqueamento. No entanto, as proteínas fluorescentes pode retornar do estado escuro sem estar permanentemente branqueada 18. Tais moléculas, então, ser contado várias vezes. Em quarto lugar, as proteínas marcadas são expressos como transgenes e são muitas vezes presentes em múltiplas cópias, o que pode conduzir a sobre-expressão. Assim, a quantificação de palma podem ser usados ​​para estimar com precisão, mas não determinar o número de moléculas de uma dada localização. O alinhamento de uma imagem PALM com uma micrografia de electrões pode também ser um desafio devido à diferença de resolução de microscopia óptica e electrónica e distorção provocada pelo feixe de electrões. Partículas de ouro servir bem locdesmineralizada marcadores fiduciais em microscopia eletrônica. No entanto, fluoresecence de partículas de ouro não é foto-ativado, e aparece como uma mancha de difração limitada de grande porte. Assim, a colocação de uma imagem de fluorescência ao longo de uma fotografia de microscopia electrónica é uma estimativa. Distorções também pode surgir a partir de interações dos elétrons com a secção de plástico. Resinas acrílicas tais como GMA são menos estáveis ​​sob o feixe de electrões, e as dimensões do que o plástico pode ser alterada. Sob estas circunstâncias, o alinhamento da fluorescência com ultraestrutura pode requerer a transformação não linear dos marcadores fiduciais.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente ou do equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Alta pressão congelador </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> EMPact e HPM 100 da Leica ou hpf-01 a partir de Wohlwend também podem ser usados. </td></tr><tr><td> Unidade de substituição automática congelamento </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 também pode ser usado. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon e Vutara também vender microscópios PALM comerciais. </td></tr><tr><td> Microscópio eletrônico de varredura </td><td> FEI </td><td> Nova nano </td><td> Outros microscópios de alta resolução de SEM pode ser usado. </td></tr><tr><td> Acetona </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-aldrich </td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Ósmio tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> O permanganato de potássio </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Sigma-aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de uranilo </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> pH de acetato de uranilo a partir desta empresa é ligeiramente maior. </td></tr><tr><td> Metacrilato de glicol (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> Ácido baixo, grau TEM. </td></tr><tr><td> N, N-dimetil-p-toluidina </td><td> Sigma-aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo frascos </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Frascos de vidro </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> Filme Aclar </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM cápsula </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Polipropileno </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DISCO socos </td><td> Ted Pella </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> As nanopartículas de ouro </td><td> microesferas-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> Pedir solução concentrada 2x </td></tr></tbody></table>

nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy

Mapear a distribuição de proteínas é essencial para a compreensão da função de proteínas numa célula. A microscopia de fluorescência é usado extensivamente para localização de proteínas, mas contexto subcelular é frequentemente ausente em imagens de fluorescência. Imuno-microscopia electrónica, por outro lado, pode localizar as proteínas, mas a técnica é limitada pela falta de anticorpos compatíveis, a preservação da morfologia pobre e porque a maioria dos antigénios não estão expostos à superfície da amostra. Abordagens correlativas pode obter a imagem de fluorescência a partir de uma célula inteira em primeiro lugar, quer a partir de imuno-fluorescência ou proteínas geneticamente marcadas. A amostra é, em seguida, fixadas e incluídas para a microscopia electrónica, e as imagens são correlacionados 1-3. No entanto, a imagem de baixa resolução da fluorescência e da falta de marcadores fiduciais exclui a localização precisa de proteínas. Alternativamente, imagens de fluorescência pode ser feito após a preservar o espécime em plástico. EmNesta abordagem, o bloco é seccionado, e as imagens de fluorescência e as micrografias electrónicas de a mesma secção são correlacionados 4-7. No entanto, o limite de difracção de luz na imagem correlacionada obscurece as localizações das moléculas individuais, e a fluorescência frequentemente se estende para além do limite da célula. Nano-resolução de fluorescência microscopia eletrônica (nano-FEM) é projetado para localizar proteínas em escala nanométrica por imagens usando as mesmas seções de foto-ativado microscopia localização (PALM) e microscopia eletrônica. PALM ultrapassa o limite de difracção por imagem individuais proteínas fluorescentes e, subsequentemente, o mapeamento do centroide de cada mancha fluorescente 8-10. Nós delineamos a técnica de nano-FEM em cinco etapas. Em primeiro lugar, a amostra é fixa e incorporado utilizando condições que preservam a fluorescência de proteínas marcadas. Em segundo lugar, os blocos de resina são cortados em segmentos ultrafinas (70-80 nm), que são montadossobre uma tampa de vidro. Em terceiro lugar, é criada uma imagem de fluorescência nestas secções, utilizando o microscópio Zeiss PALM. Quarta, estruturas densas de elétrons são gravadas nestas mesmas seções usando um microscópio eletrônico de varredura. Em quinto lugar, as micrografias de fluorescência e de electrões são alinhadas usando partículas de ouro como marcadores fiduciais. Em resumo, a localização subcelular de proteínas marcadas com fluorescência pode ser determinada com alta nanometros em cerca de uma semana.

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Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Descreve-se um método para localizar proteínas marcadas por fluorescência em micrografias electrónicas. A fluorescência é inicialmente localizado utilizando foto-activado microscopia localização em cortes ultrafinos. Estas imagens são então alinhadas com micrografias electrónicas da mesma secção.

Nano-Fem: localização de proteínas usando a foto-ativada Microscopia Localização e Microscopia Eletrônica

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

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