Name: nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy at JoVE.com

Мы благодарим Harald Hess и Эрик Betzig для доступа к PALM микроскоп для доказательства правильности принципа экспериментов, Ричард Феттер для обмена фиксации протоколов, реактивы и поддержку. Мы благодарим Майкла Дэвидсона, Джеральдин Сейду, Стефан Eimer, Рудольф Leube, Кейт Nehrke, христианские Frøkjr-Йенсена, Aude Ada-Нгема и Марк Хаммарлунд для ДНК-конструкций. Мы также благодарим Carl Zeiss Инк для обеспечения доступа к Zeiss PAL-M, бета-версия Zeiss Elyra микроскопом P.1 PALM.

<ol>
	<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers.">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. Neuroanat. 4, 24 (2010).</li><li>Bishop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+branding+efficiently+correlates+light+and+electron+microscopy.">Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).</li><li>Sims, P. A., Hardin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-integrated+transmission+electron+microscopy+images:+integrating+fluorescence+microscopy+with+transmission+electron+microscopy.">Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).</li><li>Micheva, K., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+method+for+cryofixation+and+correlative+light,+electron+microscopy+and+tomography+of+zebrafish+embryos.">A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos.</a> Traffic. 10, 131-136 (2009).</li><li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision.">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Weibull, C., Christiansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+proteins+and+membrane+lipids+during+low+temperature+embedding+of+biological+material+for+electron+microscopy.">Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy.</a> J. Microsc. 142, 79-86 (1986).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy.">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li><li>F lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates.">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nature Methods. 7, 717-719 (2010).</li><li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+background-free,+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+(SOFI).">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li><li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleaching/blinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules.">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li></ol>

Производство и свободный доступ к этой статье проводится при финансовой поддержке Carl Zeiss, Inc

Здесь мы расскажем, как сохранить флуоресцентных белков из пластика, локализовать флуоресцентных белков в секциях, и изображение ультраструктуры с помощью электронной микроскопии. Белки были локализованы ниже дифракционного предела использования PALM микроскопии для нанометровым разрешением. Чтобы адаптировать этот протокол для образцов частности, следующие параметры должны быть рассмотрены: флуорофором, количественного и выравнивание. Выбор флуоресцентного белка или органических флуорофора зависит от приложения и модели системы. Мы протестировали различные флуоресцентные белки, в том числе EGFP, YFP, цитрин, mEosFP, mEos2, ТДУС, Morange, PA-mCherry, и Dendra 12. Сохранения флуоресценции от каждого флуорофора был похож, предполагая, что все флуоресцентные белки могут быть сохранены с использованием описанного метода. Мы выбрали ТДУС потому что она хорошо выражена в C. Элеганс, белки остаются функциональными, когда слит с ТДУС, а потому, что егофото активации характеристики являются оптимальными для PALM микроскопии. Тем не менее, агрегации или не выражение ТДУС была иногда наблюдается 12. В зависимости от области применения различных флуорофор может быть лучше подходит. Во многих случаях это не обязательно использовать фото-активированного флуоресцентного белка. Простой корреляционного флуоресцентной микроскопии электронов не требуется фото-активированного флуоресцентного белка. GFP или органические красители могут быть использованы для изображения флуоресценции от меченных белков в разделах выше дифракционного предела. Например, можно изображении аксонов в нейропиля с помощью флуоресцентной микроскопии и соотносить флуоресцентного сигнала с аксона в частности электронного микроскопа с помощью методов визуализации флуоресценции от флуоресцентного микроскопа. Другая супер-разрешение методов, таких как вынужденное излучение микроскопии истощения (STED) 12, основное состояние истощения микроскопии последующим возвращением отдельных молекул (GSDIM) 13, иструктурированного освещения микроскопа (SIM) 14, не требующие фото-активированного флуоресцентных белков. Кроме того, супер-разрешение методы визуализации, которые используют органические красители 9,15,16 или внутреннего свойства флуоресцентных зондов 17, легко применимы. В PALM, число молекул может быть определена количественно, потому что флуоресценция каждая молекула отделяется во времени и пространстве. Тем не менее, количественное может ввести в заблуждение по четырем причинам: окисление, недоучет, overcounting, а избыточная экспрессия. Во-первых, доля флуоресцентных белков может быть денатурированный или окисленных во время обработки образцов 5,12. Несмотря на ~ 90% флуоресцентного сигнала была сохранена через фиксацию и вложения в нашем протоколе, окисление флуоресцентный белок может произойти после того, как образец был разрез и поверхности подвергаются воздействию кислорода. Во-вторых, активизация фото-активируемых белков является стохастической, и таким образом несколько молекул может бытьактивирован в данный дифракционного предела месте 8. Флуоресценция из нескольких молекул появится в одном месте, и таким образом общее количество белков будет занижались. В-третьих, подобная проблема может привести к overcounting. В PALM, каждый флуоресцентный белок локализован, а затем &quot;стирается&quot; при отбеливании. Тем не менее, флуоресцентные белки могут вернуться из темной государством, не являясь постоянно отбеленные 18. Такие молекулы затем будут учитываться несколько раз. В-четвертых, отмеченных белки экспрессируются как трансгены и часто присутствуют в нескольких экземплярах, которые могут привести к избыточной экспрессии. Таким образом, количественная из пальмовых может быть использован для оценки, но не точно определить число молекул в данном месте. Выравнивание PALM изображения с электронного микроскопа также может быть сложным в связи с резолюцией разница в световой и электронной микроскопии и искажения, вызванные электронного пучка. Золотые частицы служить плотно осмическое, реализующееся доверительное маркеров в электронном микроскопе. Тем не менее, fluoresecence из золотых частиц не фото-активированный, и выглядит как большой дифракционной месте. Таким образом, размещение флуоресценции изображение на электронной микрофотографии является приблизительным. Искажения могут возникать также от взаимодействия электронов с пластиковыми разделе. Акриловые смолы, такие как GMA менее устойчивы под электронным пучком, и размеры пластиковым могут быть изменены. В этих условиях, совместив флуоресценции с ультраструктуры может потребовать нелинейного преобразования координатных маркеров.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагентов и оборудования </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Высокого давления морозильной камере </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> EMPact и HPM 100 от Leica или HPF-01 от Вольвенд также может быть использован. </td></tr><tr><td> Автоматизированный блок замещения замораживания </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 также может быть использован. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon и Vutara также продать коммерческую микроскопы PALM. </td></tr><tr><td> Сканирующий электронный микроскоп </td><td> FEI </td><td> Новая нано </td><td> Другие высоким разрешением SEM микроскоп может быть использован. </td></tr><tr><td> Ацетон </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> Этанол </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Осмий тetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> Перманганат калия </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> Альбумин из бычьего сывороточного </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Уранилацетата </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> рН уранилацетата этой компании несколько выше. </td></tr><tr><td> Гликоль метакрилата (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> Температура кислоты, TEM класса. </td></tr><tr><td> N, N-диметил-п-толуидин </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo флаконах </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Стеклянные флаконы </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar фильм </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> СиEEM капсулы </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Полипропилен </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DISC ударов </td><td> Ted Pella </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> Наночастицы золота </td><td> Микросферы-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> Заказать 2x концентрированный раствор </td></tr></tbody></table>

nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy

Сопоставление распределения белков имеет важнейшее значение для понимания функции белков в клетке. Флуоресцентная микроскопия широко используется для локализации белков, но субклеточных контексте часто отсутствует в флуоресцентных изображений. Иммуно-электронной микроскопии, с другой стороны, могут локализовать белки, но технику ограничена из-за отсутствия совместимого антител, плохой сохранности морфологии и потому, что большинство антигенов не подвергаются поверхности образца. Корреляционный подход может приобрести флуоресценции изображение из целой клетки первого, ни от иммунофлуоресценции или генетически меченных белков. Затем образец фиксированной и встроенные для электронной микроскопии, а образы соотносятся 1-3. Тем не менее, с низким разрешением флуоресценции изображение и отсутствие доверительных маркеров исключает точной локализации белков. Кроме того, флуоресцентная микроскопия может быть сделано после сохранения образцов в пластик. Втакой подход, блок срезы и флуоресцентных изображений и электронной микроскопии того же раздела коррелирует 4-7. Тем не менее, дифракционного предела света в коррелированных изображений скрывает места отдельных молекул, и флуоресценции часто простирается за пределы клетки. Нано-разрешение флуоресценции электронной микроскопии (нано-МПП) предназначен для локализации белков в нано-масштабе изображения те же разделы с использованием фото-активированный локализации микроскопии (PALM) и электронной микроскопии. PALM преодолеть дифракционный предел визуализации отдельных флуоресцентных белков, а затем отображение центр тяжести каждой флуоресцентной 8-10 места. Мы выделяем нано-FEM техники в пять шагов. Во-первых, выборка является фиксированной и встроенные используя условия, которые сохраняют флуоресценции меченых белков. Во-вторых, смола блоки подразделяются на ультратонкие сегмента (70-80 нм), которые монтируютсяна крышке стекла. В-третьих, флуоресценция изображается в этих разделах помощью микроскопа Zeiss PALM. В-четвертых, электронно плотные структуры изображаются в этих же разделах с помощью сканирующего электронного микроскопа. В-пятых, флуоресценции и электронного микроскопа приведены в соответствие с использованием золотых частиц доверительное маркеров. Таким образом, внутриклеточной локализации флуоресцентно меченных белков может быть определена на нанометровым разрешением приблизительно в одну неделю.

Watch this Scientific Journal Video about Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy at JoVE.com

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Мы описываем метод для локализации флуоресцентно меченных белков в электронном микроскопе. Флуоресценция сначала локализованы с использованием фото-активированный локализации микроскопии ультратонких срезов. Эти изображения затем выравнивается по электронной микрофотографии того же раздела.

Нано-FEM: Белка Локализация с использованием фото-активированного микроскопии локализации и электронная микроскопия

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Одновременное Многоцветный изображений биологических структур с флуоресцентной фотоактивации локализации микроскопии

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Тандем Замораживание высокого давления и резких похолоданий Замена тканей растений для просвечивающей электронной микроскопии

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Количественное экспрессии белка и совместной локализации Использование Multiplexed иммуногистохимическое окрашиванием и мультиспектральных визуализации

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Трехмерная Суперразрешение Микроскопия F-актин филаментов интерферометрической фотоактивированного локализации микроскопии (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Многоцветные локализации микроскопия одного мембранных белков в органеллами живой Mammalian клеток

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Подготовка биологический образец высокого давления замораживания, при содействии Микроволновая печь контрастности и минимальным смолы, встраивание образов тома

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Визуализация структуры лимфатических узлов и клеточной локализации с помощью ex-Vivo Confocal Микроскопии

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Метод CryoAPEX для анализа электронной микроскопии мембранного белка в ультраструктурно-заповедных клетках

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Analyzing the ÃƒÅ½Ã‚Â±-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Анализ сети α-Актинин в кардиомиоцитах, полученных человеком iPSC, с использованием микроскопии локализации одной молекулы

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Подготовка криоэлектроновой микроскопической сетки для исследований с временным разрешением с использованием новой роботизированной системы Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...