Name: polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies
Uploaded: 2012-05-22T12:00:00
Duration: 9 min
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試薬を設定し、ゲルを注ぐとカリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）エリン·サンダースにインスピレーション、ガイダンス、およびサポートのために、原稿を校正するためのカリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）クリスReddiに感謝します。私もGAL3遺伝子を増幅するために酵母ゲノムDNAとプライマーを供給するためのジャンカルロCostagutaとグレゴリー·S.ペインに感謝したいと思います。 4 - 私もラボ機器および図2を作るために使用する試薬の写真を撮るためにBhairav​​シャーに感謝します。このプロジェクトの資金は、HHMI（ハワードグラント番号52006944）によって提供されていました。

<ol>
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私は、開示することは何もありません。

PCRは、生物科学兵器で欠かせないツールとなっています。 PCRは、さらに生化学的な分析のためのゲノムと多様性だけでなく、単にクローニング遺伝子の洞察を得て、生物学者はゲノムを支配する力を得て、具体的かつ正確な臨床試験を可能にする、新たな機能を備えたハイブリッド遺伝子を加えることができ、科学のコースを変更した。 PCRアプリケーションは、その力を行使する科学者の想像力によって制限されます。そこにPCRの新しい特殊な使用法を説明し、多くの書籍や論文があり、多くは生物科学の次の世代にわたって開発されます。しかし、関係なく、予想されるアプローチは、基本的なフレームワークが変わっていません。 PCRは、そのすべての壮大さには、in vitroでのアプリケーション内の DNAの特定のセグメントを大量に生成することです。 PCR実験を設計する思想と忍耐を必要とします。図3に示す結果は、主要なチャンネルの一つを例示PCRの最適化戦略を設計する際にallenges。 PCRの1つのパラメータが変更されているつまり、それは相互に影響を与える可能性があります。例として、初期のPCRは最適なMgを2でサブ最適なアニーリング温度（58℃）で実施された場合、2.0 mMの+濃度、その結果は図3cに見られるように塗抹標本を生成します。塗抹標本を解決しようとすると、2.0 mMのMgCl 2を含む反応とPCR条件を設定し、61℃にアニール温度を調整伴うかもしれないしかし、図3aに示すように、これは任意の生成物を得ませんでした。したがって、むしろ誤った結果のトラブルシューティングを行うときに、単一の反応に1つの濃度を追加することなく、試薬を滴定することをお勧めします。また、PCR実験を最適化するために必要とされる最も一般的な調整は、Mg 2 +濃度を変更し、アニール温度を修正することです。ただし、これらの変更は最小限に抑えたり、異常な結果を廃止、additiの滴定しない場合VESおよび/または表2-6に説明したようにサイクリング条件のプロトコルを変更するには、問題を軽減することがあります。他のすべてが失敗した場合は、プライマーを再設計して、もう一度試してみてください。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> Taqポリメラーゼ Polymeras </td><td>シグマ</td><td> D4545-25UN </td><td></td></tr><tr><td>のdNTP </td><td>キアゲン</td><td> 201225 </td><td></td></tr><tr><td> 0.2ミリリットル薄壁チューブPCRチューブ</td><td>バイオラッド社</td><td> 223-9469 </td><td></td></tr><tr><td> 0.2ミリリットル薄壁管のキャップ</td><td>バイオラッド社</td><td> 223-9472 </td><td></td></tr><tr><td> TEバッファー： </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EDTA二ナトリウム塩二水和物</td><td>シグマ</td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma-HClを</td><td>シグマ</td><td> T-3253 </td><td></td></tr><tr><td>カスタムファージ入門</td><td>インビトロジェン</td><td colspan="2"> 25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG </td></tr><tr><td>カスタムファージ入門</td><td>インビトロジェン</td><td colspan="2"> 26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT </td></tr><tr><td>カスタム酵母入門</td><td>統合されたDNAの技術</td><td colspan="2">のSacI-Gal3（-256）ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG </td></tr><tr><td>カスタム酵母入門</td><td>統合されたDNAの技術</td><td colspan="2"> Gal3（1848）をSacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG </td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>バイオラッド社</td><td> 170-9703 </td><td>私のサーマルサイクラー</td></tr><tr><td>アガロース</td><td> ISC BioExpress </td><td> E-3120-500 </td><td></td></tr><tr><td>ゲル電気泳動</td><td> Hoeffer科学機器</td><td>モデルHE33 </td><td></td></tr><tr><td> 1 kbのDNAラダー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> N3232S </td><td></td></tr><tr><td>バイオラッド社パワーパック</td><td>バイオラッド社</td><td> 164-5050 </td><td> PowerPacは基本的な</td></tr><tr><td>ゲルドクシステム</td><td> Fotodyne株式会社</td><td colspan="2"> FOTO /アナ捜査FXワークステーション</td></tr></tbody></table>

polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies

生物学の発見の黄金時代に規律をカタパルト技術の進歩がありました。例えば、微生物学の分野は​​、科学者が初めての原核生物を可視化することができアントン·ファン·レーウェンフックの顕微鏡の出現で形質転換した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の開発は、その影響は生物学で無数のsubdisciplinesにまたがると分子科学のコースを変更された技術革新の一つです。理論的なプロセスは1971年にKeppeや同僚で概説された、完全なPCR手順はシータス社の1985年の間にキャリーマリスによって記述され、実験的に適用されるまで、しかし、それは別の14年であった。この手法の自動化と洗練は、細菌サーマスのアクア 、結果的に名前のTaq DNAポリメラーゼの熱安定性DNAポリメラーゼの導入により、進行した。 PCRは、ポウです。出発材料の少量（すなわち、鋳型DNAまたは標的配列）のみからのDNAの特定のセグメント（すなわち、アンプリコン）の十分な供給を生成することができますrful増幅技術。単純な、一般的にトラブルフリーながら、誤った結果を生成する反応を複雑に落とし穴があります。 PCRが失敗したとき、それはアガロースゲル上のバンドのラダーまたはスメアとして現れ、さまざまなサイズの多くの非特異的なDNAの製品につながることができます。時々ない製品は全く形成されない。突然変異は意図せずにPCR産物の不均一な集団で、その結果、増幅産物に導入されたときに、別の潜在的な問題が発生します。忍耐と慎重なトラブルシューティングが整理し、問題（s）を解決するために採用されていない限り、PCRの失敗は、イライラになることができます。このプロトコルは、PCRの基本原理を概説し、ほとんどの標的配列の増幅をもたらす方法論を提供し、反応を最適化するための戦略を提示。このPCRガイドは、stに従うことにより、udentsのことができるようになります。 <ul><li>従来のPCR実験のための反応と熱サイクル条件を設定</li><li>様々な反応成分の機能とPCR実験で彼らの全体的な効果を理解する</li><li>任意のDNAテンプレートのPCR実験の設計と最適化</li><li>失敗したPCR実験のトラブルシューティング</li></ul>

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Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

PCRは、多くの分子生物学の研究室で一般的な手法として登場しました。いくつかの従来のPCRプロトコルへのクイックガイドですここで提供される。各反応はユニークな実験であるため、製品を生成するために必要な最適な条件は異なります。反応の変数を理解することは非常に所望の結果を得ることができる機会を増やすことは、トラブルシューティングの効率を向上させます。

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