Name: polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies
Uploaded: 2012-05-22T12:00:00
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Agradecimentos especiais a Kris Reddi na UCLA para a criação de reagentes e derramando géis e Erin Sanders na Universidade da Califórnia em busca de inspiração, orientação e apoio e revisão do manuscrito. Gostaria também de agradecer a Giancarlo Costaguta e S. Gregório Payne para o fornecimento do DNA genômico de levedura e primers para amplificar o gene GAL3. Gostaria também de agradecer Shah Bhairav ​​para fotografar o equipamento de laboratório e reagentes utilizados para fazer figuras de 2 a 4. O financiamento para este projeto foi fornecido pelo HHMI (HHMI Grant No. 52006944).

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Não tenho nada para revelar.

PCR tornou-se uma ferramenta indispensável no arsenal da ciência biológica. PCR alterou o curso da ciência permitindo biólogos para se obter o poder sobre genomas, e fazer genes híbridos com novas funções, permitindo específico e preciso testes clínicos, ganhando percepções do genoma e diversidade, bem como genes simplesmente de clonagem para a análise bioquímica adicional. Aplicação PCR é limitado apenas pela imaginação do cientista que exerce o seu poder. Há muitos livros e artigos que descrevem novos usos especializados de PCR, e muitos mais serão desenvolvidas durante a próxima geração da ciência biológica. No entanto, independentemente das abordagens previstas, o quadro fundamental continua o mesmo. PCR, em toda a sua grandeza, é uma aplicação in vitro para gerar grandes quantidades de um segmento específico de ADN. Projetando um experimento PCR requer pensamento e paciência. Os resultados mostrados na Figura 3 exemplificam um do ch grandeallenges ao projetar uma estratégia de otimização para a PCR. Isto é, como um parâmetro de PCR é alterado, ele pode ter impacto outro. Como um exemplo, se a PCR inicial foi realizada à temperatura de sub-óptima de recozimento (58 ° C) com um óptimo 2 + Mg concentração de 2,0 mM, então o resultado seria produzir um esfregaço como visto na Figura 3c. Uma tentativa para resolver o esfregaço pode envolver a criação de condições de PCR com reacções contendo 2,0 mM de MgCl2 e ajustando a temperatura de recozimento de 61 ° C. No entanto, como pode ser visto na Figura 3a, isto não produz qualquer produto. Por conseguinte, é aconselhável para titular os reagentes, em vez de adicionar uma concentração para uma reacção única, quando a resolução de resultados falsos. Além disso, os ajustes mais comuns que são necessários para a optimização de um experimento PCR são para alterar a concentração de Mg 2 + e para corrigir as temperaturas de recozimento. No entanto, se essas mudanças não minimizar ou anular os resultados aberrantes, a titulação de additives e / ou alterando os protocolos de ciclismo condição, como descrito nas Tabelas 2-6 pode aliviar o problema. Se tudo mais falhar, redesenhar os primers e tente, tente novamente.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Taq Polymeras </td><td> Sigma </td><td> D4545-25UN </td><td></td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Qiagen </td><td> 201225 </td><td></td></tr><tr><td> 0,2 ml de Parede Fina Tubos PCR tubos </td><td> Bio Rad </td><td> 223-9469 </td><td></td></tr><tr><td> 0,2 ml tampas de tubos de Parede Fina </td><td> Bio Rad </td><td> 223-9472 </td><td></td></tr><tr><td> TE Buffer: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EDTA sal dissódico dihidratado </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma-HCl </td><td> Sigma </td><td> T-3253 </td><td></td></tr><tr><td> Primer Phage personalizado </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG </td></tr><tr><td> Primer Phage personalizado </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT </td></tr><tr><td> Primer fermento personalizado </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td colspan="2"> SacI-Gal3 (-256) ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG </td></tr><tr><td> Primer fermento personalizado </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td colspan="2"> Gal3 (1848)-SacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG </td></tr><tr><td> Termociclador </td><td> Bio Rad </td><td> 170-9703 </td><td> My Cycler </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> ISC BioExpress </td><td> E-3120-500 </td><td></td></tr><tr><td> A electroforese em gel </td><td> Hoeffer Scientific Instruments </td><td> Modelo HE33 </td><td></td></tr><tr><td> 1 Ladder DNA kb </td><td> New England Biolabs </td><td> N3232S </td><td></td></tr><tr><td> Bio Rad Power Pack </td><td> Bio Rad </td><td> 164-5050 </td><td> PowerPac básico </td></tr><tr><td> Gel Doc sistema </td><td> Fotodyne Incorporated </td><td colspan="2"> FOTO / Analista Investigador Workstation FX </td></tr></tbody></table>

polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies

Nas ciências biológicas tem havido avanços tecnológicos que elevaram a disciplina em épocas de ouro da descoberta. Por exemplo, o campo da microbiologia foi transformada com o advento de microscópio Anton van Leeuwenhoek, que permitiu que os cientistas visualizar procariotas, pela primeira vez. O desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma dessas inovações que mudaram o curso da ciência molecular com o seu impacto abrangendo subdisciplinas incontáveis ​​na biologia. O processo teórico foi descrito por Keppe e colaboradores em 1971, no entanto, era mais de 14 anos até que o procedimento de PCR completa foi descrito e aplicado experimentalmente por Kary Mullis, enquanto ao Cetus Corporation, em 1985. Automatização e refinamento desta técnica progrediu com a introdução de uma polimerase de ADN termicamente estável a partir do Thermus aquaticus bactéria, consequentemente, o nome da polimerase de DNA Taq. A PCR é um powetécnica de amplificação rful que pode gerar um grande suprimento de um segmento específico de ADN (ie, um fragmento amplificado) a partir de apenas uma pequena quantidade de material de partida (isto é, o modelo de DNA ou sequência alvo). Embora simples e geralmente sem problemas, existem armadilhas que dificultam a reação produzindo resultados falsos. Quando PCR falhar pode levar a muitos produtos não específicos de ADN de tamanhos variados que aparecem como uma escada ou mancha de bandas no gel de agarose. Às vezes produtos não formam em tudo. Outro problema potencial ocorre quando as mutações são intencionalmente introduzido nos amplicons, resultando em uma população heterogénea de produtos de PCR. Falhas de PCR pode se tornar frustrante a menos paciência e resolução de problemas cuidado são utilizados para classificar e resolver o problema (s). Este protocolo descreve os princípios básicos de PCR, fornece uma metodologia que irá resultar em amplificação de sequências de a maioria dos alvos, e apresenta estratégias para optimizar uma reacção. Ao seguir este guia de PCR, students deve ser capaz de: <ul><li> Configure reações e condições ciclos térmicos para um experimento de PCR convencional </li><li> Compreender a função dos componentes de reação diversas e seu efeito global sobre um experimento de PCR </li><li> Projetar e otimizar um experimento de PCR para qualquer modelo de DNA </li><li> Solucionar problemas de experiências fracassadas de PCR </li></ul>

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Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

PCR emergiu como uma técnica comum em muitos laboratórios de biologia molecular. Desde aqui está um guia rápido para vários protocolos convencionais de PCR. Porque cada reacção é uma experiência única, as condições óptimas necessárias para gerar um produto variar. Compreender as variáveis ​​em uma reação vai aumentar muito a eficiência de resolução de problemas, aumentando assim a chance de obter o resultado desejado.

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