Name: use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases
Uploaded: 2012-09-01T14:00:00
Duration: 20 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases at JoVE.com

この仕事に貢献し、ほとんどが膜構造·機能研究グループからのもので、過去と現在の両方のメンバーが多くの人々があります。すべての我々の暖かい感謝と感謝の意を。この作品は、アイルランド科学財団（07/IN.1/B1836）、国立衛生研究所（GM75915、P50GM073210とU54GM094599）、およびFP7 COSTのアクションCM0902からの助成金によって部分的にサポートされていました。

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	<li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (45), e1712 (2010).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (49), e2501 (2011).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Bio.l Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li><li>Peddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+automated+system+for+crystallizing+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">High-throughput automated system for crystallizing membrane proteins in lipidic mesophases.</a> IEEE Trans. Autom. Sci. Eng. 4, 129-140 (2007).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure-function+studies+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure-function studies using lipidic mesophases.</a> Biochem. Soc. Trans. 39, 725-732 (2011).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination:+use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+crystallization.">Membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 142, 108-132 (2003).</li><li>Gushchin, I., Reshetnyak, A., Borshchevskiy, V., Ishchenko, A., Round, E., Grudinin, S., Engelhard, M., Buldt, G., Gordeliy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+State+of+Sensory+Rhodopsin+II:+Structural+Determinants+for+Signal+Transfer+and+Proton+Pumping.">Active State of Sensory Rhodopsin II: Structural Determinants for Signal Transfer and Proton Pumping.</a> J. Mol. Biol. 412, 591-600 (2011).</li><li>Jordan, P., Fromme, P., Witt, H. T., Klukas, O., Saenger, W., Krauss, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+angstrom+resolution.">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 angstrom resolution.</a> Nature. 411, 909-917 (2001).</li><li>Grawert, T., Span, I., Eisenreich, W., Rohdich, F., Eppinger, J., Bacher, A., Groll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+reaction+mechanism+of+IspH+protein+by+x-ray+structure+analysis.">Probing the reaction mechanism of IspH protein by x-ray structure analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 1077-1081 (2010).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins.">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 39, 604-606 (2006).</li><li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+cryo-cooling+crystals+of+membrane+proteins+grown+in+lipidic+mesophases+for+structure+determination+by+macromolecular+crystallography.">Harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography.</a> J. Vis. Exp. (67), e4001 (2012).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このビデオの記事では、我々は自動的にタンパク質を含んだ脂質メソフェーズを用いて、96ウェルガラスサンドイッチプレートにメソ結晶化試験でセットアップするロボットを使用する方法を実証した。本研究で使用したロボットは特別にもともと7に記載されているように 、粘性及び粘着性メソフェーズのナノリットルボリュームの正確で再現性の送達のための肯定的な変位のガラスシリンジを含むように設計されていました。 正確さと精度は、ロボットの重要な機能です。しかし、これらの特徴は、ロボットの性能が評価され、キャリブレーションが実行される程度と規則性と同じくらい良いです。それは個々のプレートが設定されている間、ロボットの性能が評価されるべきことは言うまでもない。それはロボットが完璧に機能し、自動で実行するロボットを残していると仮定することは適切ではない。気配りと観察オペレータがposにあるべきitionは音か何かが正常に動作していないと、すぐにそれを修正するために外観によって注意を促す必要があります。 プレートがシールされているとすぐに、それが結晶化試験のために離れて置かれる前に加えて、 各プレートを慎重によく内容の均一性のために目の検査を受けなければならない 。これは、ほんの数秒で実行するようにする必要がありますし、次のプレートをロードしている間に行うことができます。気付かは、例えば、特定のウェルが正しく入力されていないことは確か沈殿分配チップが誤動作しているという事実を強調することができる。メソフェーズの配信は不定期であると見なければならない、関連する障害のある項目は直ちに修正される必要があるでしょう。これらの問題を指摘し、セットの間の関連の調整を行うことにより、貴重な脂質や膜タンパク質など、時間と材料の節約になります。イメージャは、結晶成長、正確さと精度を追跡するために使用されている場合は、撮像中に監視することができます。ドロップまたはボーラスを持つ例えば、体系的な問題イメージャによって場所は、何かが右ではなく、プロトコルのどこか上流の是正措置が必要であることを示す。 信頼性の高い性能故にロボットの利益のために、定期的なスケジュールで校正され、必要に応じなければなりません。校正は、沈殿剤およびウェル内ボーラスと沈殿配置と同様に配信メソフェーズのボリュームを含める必要があります。明らかに、可能な限りキャリブレーションは品質管理運動の対象期間内に実施された試験で使用されるものと同様のボリュームと材料を使用して行われる必要があります。 キャリブレーションと同様に重要なのは、あまりにも在庫がロボットの部品や消耗品の適切な供給を持っているそうです。破局や予期しない障害、閉塞とクラッシュが発生するとを行うことができます。このような場合には、使用可能な交換用沈殿配信先端を有する、例えば、非常に貴重な膜タンパク質調製物は、それが必要ととして使用されていることを意味するかもしれません無駄にされていません。 ロボットの利点のいくつかは、それが本質的に連続的に動作すること、それは苦しんでいないか、または疲労 &quot;が訴える&quot;という事実を含む。ロボットはまた、暗闇の中でのように、制御された照明や環境条件の下で、温度の極端で、人に優しいとは見なされません条件の下で使用することができます。この記事で紹介ロボットはすべての〜20℃周囲条件下で使用されましたしかし、タンパク質および非周囲温度、制御された光11,12及び酸化剤または還元環境13を必要とするプロジェクトがあります。結晶化ロボットが使用されている場合、これらのすべては、比較的容易に、用の仕出し料理することができます。 以前Joveのビデオ記事ではメソメソッド内で結晶化試験は手動で1に設定されている方法を紹介しました。手で確実に分配することができる中間相の最小体積はb限られているyの試験を設定する人の視力と着実利き手。我々の経験では、100 nlの限り低くメソフェーズのボリュームが容易に処理されます。我々は、デフォルトのボリュームが40 NL約手動ディスペンス1研究室を知っている。しかし、かなり小さいボリュームがロボットを使って行うことができます。これとは別に、我々は550ピ ​​コリットルという低メソフェーズボリュームがロボット14分配することができることが示されている。その作品からは、ロボットによる更なる小型化が実施されれば、結晶化実験を行うのに必要な貴重な膜タンパク質の量の大幅な削減につながる、これが可能であることは明らかでした。 このビデオの記事では、3種類の市販のロボットは脂質中間相を用いた高スループット膜タンパク質の結晶化を実証するために使用されていました。 JOVE 1712 1に記載したように、これらの最初のものは、手動で試験を設定する私たちの経験に基づいて、MS＆FBのグループで開発されました。これは楽器ですリーメントは我々に最も精通していると、現在の記事の大半は、その使用に専念しています。他の二つのロボットは、記事が書かれた、関連する映像が、完全性の利益のためにここに含まれている時に、MS＆FBのグループのデモにあった。すべての3つのロボットは非常に同じメソフェーズ分配システム、容積ガラスシリンジ5,7となっている本質的な機能を使用します。彼らは、沈殿剤デリバリーに関して最も大きく異なります。ロボット1と2は、8ウェル、同時に結晶化プレート上の単一の列に同時に沈殿剤を分配することができます。これとは対照的に、ロボット3は、単一のアクションですべての96沈殿ソリューションを分配します。ロボット2は使い捨ての沈殿剤調剤のヒントを持つ唯一の楽器です。特定のアプリケーションに依存する別の楽器に関連付けられている長所と短所がありますが、これらはここで詳しく説明されません。すべての3つの作業とは、私の結晶が得られたことを言えば十分メソメソッド内でmbraneタンパク質。 高分子結晶学による構造決定の全体的なプロセスの次のステップは収穫にとクライオクール結晶にこのビデオの記事で説明されるように設定するプレートから、レコード、それらからプロセスX線回折にしています。これらのトピックについては、このシリーズ1,15で個別Joveの記事で説明されています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コンポーネント </td></tr><tr><td> Brayer（ローラ） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 50820937 </td><td>ツール</td></tr><tr><td>ガスタイトシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td> 81030 </td><td>ツール</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td> Marienfeld </td><td> 01029990911 </td><td>使い捨て</td></tr><tr><td>ガラス板</td><td> Marienfeld </td><td> 1527127092 </td><td>使い捨て</td></tr><tr><td>グリフォンLCPのロボット</td><td>アート·ロビンス</td><td> NA </td><td>ツール</td></tr><tr><td> メソロボットで </td><td> Anachem /ギルソン</td><td> NA </td><td>ツール</td></tr><tr><td>実験ノート</td><td>さまざまな</td><td> NA </td><td>ツール</td></tr><tr><td>蚊LCPのロボット</td><td> TTP LABTECH </td><td> NA </td><td>ツール</td></tr><tr><td>あき両面スペーサテープ</td><td>サンダース株式会社（穴パンチ） </td><td>カスタマイズ</td><td>使い捨て</td></tr><tr><td>沈殿ソリューション</td><td>さまざまな</td><td>さまざまな</td><td>試薬</td></tr><tr><td>精製水</td><td>ミリポア</td><td> NA </td><td>試薬</td></tr><tr><td>雨 - X </td><td>シェルカーケア</td><td> 80199200 </td><td>試薬</td></tr><tr><td>シリンジのヒント</td><td>ハミルトン</td><td> 7770-020（ゲージ22） </td><td>ツール</td></tr><tr><td>組織</td><td>さまざまな</td><td>さまざまな</td><td>使い捨て</td></tr><tr><td>水筒</td><td>さまざまな</td><td> NA </td><td>試薬</td></tr></tbody></table>

use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases

膜タンパク質の構造と機能の研究は大いに高分子X線結晶構造解析（MX）を介して提供タイプの使用可能な高解像度の3次元構造を持っていることから恩恵を受ける。 MXの必須成分は、理想的には回折品質結晶の安定供給である。膜タンパク質の結晶化のメソまたは脂質立方相（LCP）メソッドの中で膜タンパク質を結晶化させるためのいくつかの方法の一つです。これは、結晶を成長するための共連続メソフェーズを利用しています。方法としては、後半のいくつかの壮観な成功を収めており、現在、それを使うことに興味を持って多くの研究グループと注目を集めている。メソッドに関連付けられている課題の一つは、ホスティングメソフェーズが厚い歯磨き粉を彷彿とさせる、非常に粘性と粘着性であるということです。このように、結晶化ウェルに少量で再現可能な方法でそれを手動で調剤することはスキル、忍耐と着実に手を必要とします。柱を行うためのプロトコル膜の構造·機能生物学（MS＆FB）グループ1-3に開発されたstの。方法を説明するJoveのビデオの記事が入手できる1,4です。 メソ試験で設定するための手動のアプローチは、このような結晶の最適化および誘導体化などの特殊なアプリケーションとの明確な利点を持っています。しかしそれは低スループット法であることに苦しむん。ここでは、ロボットメソ結晶化試験で行うためのプロトコルを示しています。ロボットは、スピード、正確性、精度、小型化、還元雰囲気中または低温下、または高温下で、そのような暗闇の中でのように敵対的な条件とみなすことができるもので、長期間にわたって継続的に働くことができるという利点があります。 メソロボットで 、適切に使用すれば、大幅で遅いステップの一つである結晶化を促進することにより、膜タンパク質構造の生 ​​産性と機能の研究を向上させることができます全体的な構造決定のパイプライン。 このビデオの記事では、我々は、 メソ crystallogenesis 内に不可欠粘性及び粘着性メソフェーズを免ずることができる3つの市販のロボットの使用例を示します。最初のロボットは、MS＆FBのグループ5,6で開発されました。他の二つは、最近利用可能になっていると、完全を期すためにここに含まれています。 この記事で取り上げたプロトコルの概要を図1に示されている。すべての操作は室温（約20℃）周囲条件下で行った。

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Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

本明細書では、高分子のX線結晶構造解析を用いた構造決定に使用するための脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化ロボットのアプローチを説明しています。メソッドに不可欠な粘性及び粘着性のタンパク質を含んだ中間相を扱うことができる3つのロボットが導入される。

脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

電子線結晶学による構造生物学研究用小型膜タンパク質の二次元結晶化トライアルの評価

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

X -線結晶構造のためのタンパク質の結晶化

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

高分子結晶学による構造決定のための脂質メソフェーズで栽培膜タンパク質の収穫とクライオ冷却結晶

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

意識マウスにおける糸球体濾過率の測定のためのハイスループット法

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...