Name: harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography
Uploaded: 2012-09-02T14:00:00
Duration: 18 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography at JoVE.co

Det finns många som har bidragit till detta arbete och de flesta är från Caffrey Membrane strukturell och funktionell biologi Group både tidigare och nuvarande medlemmar. Till alla, och särskilt Jingquan Tan och Joseph Lyons, förlänger vi vårt varma tack och uppskattning. Detta arbete stöddes delvis av anslag från vetenskapsrådet Irland (07/IN.1/B1836), National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 och U54GM094599) och FP7 COST och Marie Curie-åtgärder (CM0902 och PIEF-GA-2009 -235.612).

1. Laboratorie Uppsättning Pre-skörd <ol><li> Som förberedelse för skörd, fyll den torra skum Dewar med flytande kväve och placera den bredvid mikroskopet där skörden ska ske. </li><li> Sänk lagring pucken, öppna hamnar i flytande kväve inuti skummet Dewar och låt den helt cool. </li><li> Fäst en mikro-fäste med en storlek som passar kristallen som skall skördas på ett magnetiskt trollspö (Figur 5). Det är viktigt att ha till hands ett antal extra Magnetstavar förladdad med Micro-fästen för att tillgodose situationer där det är nödvändigt att skörda flera kristaller från en bolus. Spare trollstavar bör finnas tillgängliga vid alla tidpunkter. </li><li> Placera en mikropipett, tips och fällningsmedel lösning som användes för kristalltillväxt bredvid skörd mikroskop. Det kan behövas för att täcka mesofasen och att förhindra uttorkning när väl öppnas. </li><li> Ha en anteckningsbok och penna på bänken stänga av och / ellerdatorn öppna. Dessa kommer att användas för att spela in synpunkter på kvalitet, utseende, plats, lagring pucken nummer etc., kristaller som de skördas, kryo-kyls och placeras i lager. </li><li> Om en assistent är tillgänglig att hjälpa till med skörden den personen måste förstå tydligt protokoll som kommer att följas, i vilken ordning de olika stegen kommer att äga rum, och deras roll i den övergripande processen. </li></ol> Med alla de material och utrustning på plats vår nästa uppgift är att: 2. Identifiera Plattor och brunnar som innehåller kristaller <ol><li> Den enklaste och mest direkta metoden för att hitta skördas kristaller är att inspektera brunnar för hand med ett mikroskop med normal och med korsade polariserade ljus. Justering av belysande ljusstyrkan på mikroskopet kan hjälpa till med att lokalisera kristaller. </li><li> Alternativt korsade en streckkodsläsare där plattor undersöks automatiskt med normal och polariserad ljus, kan användas för att söka efter kristaller. </li><li> Utvärdera med ögat inspelade digitala bilder på en datorskärm. </li><li> Tydligt markera de brunnar med kristaller för skörd och spela kommenterar storlek, kvalitet och lokalisering av kristallerna i mesofasen i den bärbara datorn eller på en dator. </li><li> Ta bort plattan innehåller kristaller för skörd från kameran. </li></ol> 3. Öppna en brunn med kubisk mesofas. Metod 1 Plattorna som kristaller växer med i meso metoden är glas sandwich plattor (figur 2). För att få tillgång till mesofasen och kristallerna däri, är det nödvändigt att öppna brunnen. Detta görs med hjälp av ett verktyg glas skärning för att skära den övre täckglas som tätar och som sedan kan tas bort. Det finns flera metoder för att skära och ta bort täckglas från över en kristallisering väl. Den ena för att använda dikteras av typen Of mesofas där kristallen finns växer. Detta kan vara den mycket viskösa och klibbiga kubiska fasen (figur 3A) eller dess mer fluid variant svampen fasen (Figur 3B). I denna video artikeln visar vi hur man öppnar brunnar och skörda kristaller från båda dessa webbhotell material. <ol><li> Placera glasskivan smörgås kristallisation på scenen av ett ljusmikroskop. </li><li> Med en glas poäng skärande verktyget täckglas lätt med två koncentriska cirklar belägna ovanför distansorganet och strax utanför omkretsen av brunnen. Med en ny skärverktyg, kräver poäng minimalt pålagt tryck. Ersätt verktyget med en ny när trycket som krävs för att poäng ökar ännu fraktionellt, vilket normalt inträffar efter öppning 10 brunnar. </li><li> Bryt upp glaset i utrymmet mellan de skårade två cirklarna i syfte att frigöra den inre täckglas. Detta genererar massor av glas skärvor och damm. Rensa bort dem med en fuktadpappershandduk. </li><li> Ta bort den frigjorda täckglas genom att ta tag den med en fin spets pincett och luta den ifrån och utanför brunnen. I detta fall förblir den kubiska fasen och fastnat på plats på basplattan av brunnen. </li><li> Zooma in för att få en klarare bild av kubiska mesofasen som nu är klar för användning i kristall skörd. </li></ol> 4. Öppna en väl med Cubic mesofas. Metod 2 <ol><li> Använda glaset skärverktyg poäng rakt parallella linjer i täckglas på ena sidan av brunnen och som sträcker sig över den väl själv. Detta möjliggör enklare pincett tillgång till och avlägsnande av täckglas. </li></ol> I denna demonstration sprickor täckglas i att befria täckglas från den klibbiga distans yta. I processen skiftar täckglas i läge och utfällningsmedlet separerar från den kubiska fasen. När täckglas lyfts en del av fällningsmedel går med det. Vi lämnas med en utsatt bolus av mesofas utan omgivande fällningsmedel. Omedelbart, tillsätt 1 pl färsk fällningsmedel ovanpå bolus med en mikropipett för att förhindra att mesofasen från uttorkning och genomgår en fasförändring som kan skada kristallerna. Bolusen är nu klar att användas i kristall skörd. 5. Öppna en väl med svamp fas. Framgång Svampen fasen är mindre förlåtande att arbeta med på grund av dess förmåga att flyta. Om detta flöde resulterar i svampen fasen i kontakt med omkretsen av brunnen kapillaritet kommer att dra ut mesofasen och kristallerna kommer att förloras. Ett exempel på detta händer visas i detta videoklipp. <ol><li> Zooma in på svampen fasen och växla fram och tillbaka mellan normal och korsade polariserat ljus för att lokalisera kristaller i svampen fasen. </li><li> Som en förberedelse för att öppna och poäng och skär täckglas som beskrivs i avsnitt 3. I processen, spricker täckglas. I försökning för att öppna väl utfällningsmedlet förskjutningar i riktning av sprickan och till slut kommer i kontakt med distansorganet. Med fällningsmedel går en del av svampen fasen och dess last av kristaller som går förlorade. </li></ol> I denna speciella sekvens är polarisatorer på mikroskopet inte helt korsade och kristallerna kan ses som ljusa föremål samtidigt som bra och dess innehåll förblir synliga. 6. Öppna en väl med svamp fas. Framgångsrikt <ol><li> Zooma in på svampen fasen och identifiera en kristall både vid normal och korsade polariserat ljus. </li><li> Betyg, skära och ta bort en del av täckglas täcker bra, som i avsnitt 4,1. Ofullständigt korsade polariserat ljus används för att hålla reda på kristallen. </li><li> Inför en bit torrt mjukpapper genom öppningen i täckglas och in i bra tills den precis rör fällningsmedel lösningen. Transportera bort lösningen noggrannly tills den är nästan alla borta och sedan ta bort vävnaden. Detta gör att resterande utfällningsmedel och svamp fas med kristallen fortfarande på plats, att dra under täckglas. </li><li> Betyg, skära och ta bort med en pincett resten av täckglas, som i avsnitt 4,1. I detta fall delar svampen fasen, några kvar i brunnen och några pinnar till täckglas. Kristallen är i bolus på täckglas. Eftersom det finns mycket lite fällningsmedel närvarande, börjar svampen fasen att genomgå en fasövergång sannolikt på grund av uttorkning. Detta kan ses som en ring av dubbelbrytning som migrerar mot centrum av bolus. Omedelbart lägga fällningsmedel till bolus att stoppa övergången. Bolusen är nu klar för användning i kristall skörd. </li></ol> 7. Skörd och Cryo-kylning kristaller från den kubiska fasen <ol><li> Gå fram och tillbaka mellan normal och korsade polariserat ljus för att lokalisera kristaller i den kubiska fasen bolus i den öppna väl. I thans videosekvens upp till fyra dubbelbrytande kristaller kan ses i den kubiska fasen bolus med korsade polariserat ljus. </li><li> Använd en monterad kryo-slinga (Figur 5) för att undersöka den nyligen exponerade mesofasen för kristaller, att fiska ut kristaller och sedan kasta dem, som finns i kryo-bågen, i flytande kväve i Dewar omedelbart efter skörd. Helst ska avverkning och snap-kylning sker i en kontinuerlig och snabb rörelse. Så lite vidhäftande mesofas som möjligt ska skördas med kristallen. I vår erfarenhet är kryo-skyddsmedel behövs inte med i meso-odlade kristaller. </li><li> Eftersom det inte är möjligt att leta efter kristallen i kryo-loopen omedelbart efter skörd inspektera mesofasen bolus används för att skörda för att verifiera att kristallen inte längre finns tyder på att det skördades framgångsrikt. </li></ol> 8. Avverkning och Cryo-kylning Kristaller från svampen fas <ol><li> Gå fram och tillbaka mellan normal och korsade polariserat ljus för att lokalisera kristaller i svampen fas bolus i den öppna väl. I detta videosekvens många dubbelbrytande kristaller kan ses i bolus enligt korsade polariserat ljus. </li><li> Använd en monterad kryo-slinga (Figur 5) att fiska ut kristaller från svampen fasen och att kasta dem, som finns i eller på cryoloop, i flytande kväve i Dewar omedelbart efter skörd. Som med upptagning från kubisk fas, helst bör kryo-kylningsprocessen ske omedelbart kristallen skördas med så lite tid som möjligt förflyter mellan den faktiska avverkningen händelsen och kastar sig in i flytande kväve. Så lite vidhäftande svamp fas som möjligt bör skördas med kristallen. Såsom noterats, är kryo-skyddsmedel behövs inte med i meso-odlade kristaller. </li></ol> 9. Lagra kristaller i Dewars <ol><li> Efter att ha störtat den monterade slingan i flytande niTrogen placera den i en av de som håller luckorna i lager pucken i skum Dewar. Alla manipulationer görs med slingan, toppen av den magnetiska staven och pucken nedsänkt i flytande kväve. </li><li> Anteckna platsen och detaljer av skördade och kryo-kylda kristall i den bärbara datorn och / eller på datorn. </li><li> När pucken i skummet Dewar är full eller skörd för dagen är klar överföringen pucken till en hyllan puck hållare i ett lager eller en transport Dewar fylld med flytande kväve. Kristaller kan sändas i transporter Dewars till synkrotron anläggningen för diffraktion datainsamling. </li></ol> 10. Representativa resultat Målen för skörd och kryo-kylning övningar visade här är att överföra en kristall från webbhotell mesofasen till Cryo-loopar, för att förglasa den ögleförsedda kristall och placera den i lager i flytande kväve i en Dewar. Den ideala situationen är där skörd och cRyo-kylning sker på sådant sätt att diffrak kvaliteten av kristallen bevaras i processen. Så lite mesofas som möjligt ska skördas med kristallen. Det är att göra lokalisera kristallen och centrering den i röntgenstrålen så mycket mindre utmanande, för att snabba kryo-kylning för att vitrifiering, och för att minimera störande fläckar i bakgrunden från mesofasen under diffraktion datainsamling. Några exempel på kryo-kylda prover där kristallen kan och inte kan ses visas i figur 6. Om kristallen inte kan ses med ögat är det vanligtvis nödvändigt att tillgripa diffraktion rastering för att hitta kristallen och att centrera den i balken för datainsamling 27. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Schematisk representation av ett biologiskt membran visar lipidbiskiktet i och som are ligger en mängd proteiner. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. En fullastad och förseglade 96-håls glas smörgås kristallisering plattan. Varje brunn innehåller 50 nl kubisk fas och 1 pl fällningsmedel lösning. För tydlighetens skull har den kubiska fasen har färgas med Sudan Red och utfällningsmedlet lösningen innefattar metylenblått. Från referens 5. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Kristaller av membranproteiner växer i lipidiska mesofasen. A. Den kubiska fasen med en kristall av bacteriorhodopsin från H. halobium. B. svamp fas innehållande en kristall av vitamin B12-receptorn / transportör, BtuB, från E. coli. Från Referens 25. Den kubiska och svamp faser har kontrasterande appearances är lika självklart genom att jämföra paneler A och B. Den kubiska fasen i A är mycket trögflytande och behåller sin ursprungliga form. Det flödar inte. Detta är särskilt tydligt vid kanterna av de mesofas bolus som har en uppruggad utseende. Genom avtal, är svampen fasen betydligt mindre viskös och rinner. Sålunda misslyckas svampen fasen att behålla sin ursprungliga form och dess kanter är karakteristiskt slät. Utfällningsmedel som inkluderar Jeffamine, PEG 400, 2-metyl-2 ,4-pentandiol, pentaerytritol propoxylat, butandiol och hexandiol, kan resultera i en övergång från den kubiska till svampen fasen 4,26. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. Flödesdiagrammet sammanfattar de olika stegen i produktionen, skörd och kryo-kylning av i meso-odlade kristaller membranprotein (A). Endast de steg som omges av den streckade rödalinje, och beskrivs i detalj i (B), behandlas i denna JUPITER artikeln. Panel A är från referens 3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> . <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="Figur 5" /> Figur 5. En tom kryo-slinga monterad på en tapp som hålls på plats på en magnetisk stav. Utökade utsikt över stiftet (A) och mikro-fäste (B) i denna viktiga verktyg för skörd och kryo-kylning visas. Den tomma ögla vid slutet av mikro-mount i B är 30 um i diameter. Samtidigt har inte testats andra slinga typer utsträckning, finner vi att MiTeGen loopar visas fungerar bra med både de kubiska och svamp faser. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="Figur 6" /> Figur 6. Skördas och kryo-kylda kristaller av membranproteiner i kryo-loopar sett med en in-line mikroskop på en synkrotron beamline. A, B. Exempel på skördade kristaller (caa3 cytokromoxidas 34 (A), diacylglycerol kinas, DgkA (B)) där kristallerna (blå pil) är synliga genom kryo-kylda mesofas på en kryo-slinga. C. Exempel på var skördade kristallen är inte synlig i den kryo-kylda mesofas på en kryo-slinga. Spetsen på slingan identifieras med en röd pil. Den vidhäftande kryo-kylda mesofasen identifieras med en blå pil.

<ol>
	<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination:+use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M., Li, D., Dukkipati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structure+determination+using+crystallography+and+lipidic+mesophases+-+recent+advances+and+successes.">Membrane protein structure determination using crystallography and lipidic mesophases - recent advances and successes.</a> Biochemistry. , (2012).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li><li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+to+move:+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases.">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li><li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Setvens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor.">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li><li>Chien, E. Y., Liu, W., Zhao, Q., Katritch, V., Han, G. W., Hanson, M. A., Shi, L., Newman, A. H., Javitch, J. A., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+dopamine+D3+receptor+in+complex+with+a+D2/D3+selective+antagonist.">Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist.</a> Science. 330, 1091-1095 (2010).</li><li>Granier, S., Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+delta-opioid+receptor+bound+to+naltrindole.">Structure of the delta-opioid receptor bound to naltrindole.</a> Nature. 485, 400-404 (2012).</li><li>Haga, K., Kruse, A. C., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Zhang, C., Weis, W. I., Okada, T., Kobilka, B. K., Haga, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+M2+muscarinic+acetylcholine+receptor+bound+to+an+antagonist.">Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist.</a> Nature. 482, 547-551 (2012).</li><li>Hanson, M. A., Roth, B., Jo, E., Griffith, M. T., Scott, F. L., Reinhart, G., Desale, H., Clemons, B., Cahalan, S. M., Schuerer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+lipid+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor.</a> Science. 335, 851-855 (2012).</li><li>Jaakola, V. P., Griffith, M. T., Hanson, M. A., Cherezov, V., Chien, E. Y., Lane, J. R., Ijzerman, A. P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2.6+angstrom+crystal+structure+of+a+human+A2A+adenosine+receptor+bound+to+an+antagonist.">The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist.</a> Science. 322, 1211-1217 (2008).</li><li>Kruse, A. C., Hu, J., Pan, A. C., Arlow, D. H., Rosenbaum, D. M., Rosemond, E., Green, H. F., Liu, T., Chae, P. S., Dror, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor.">Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor.</a> Nature. 482, 552-556 (2012).</li><li>Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Mathiesen, J. M., Sunahara, R. K., Pardo, L., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Granier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+micro-opioid+receptor+bound+to+a+morphinan+antagonist.">Crystal structure of the micro-opioid receptor bound to a morphinan antagonist.</a> Nature. 485, 321-326 (2012).</li><li>Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Fung, J. J., Pardon, E., Casarosa, P., Chae, P. S., Devree, B. T., Rosenbaum, D. M., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Schnapp, A., Konetzki, I., Sunahara, R. K., Gellman, S. H., Pautsch, A., Steyaert, J., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta(2)+adrenoceptor.">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469, 175-180 (2011).</li><li>Rasmussen, S. G. F., Devree, B. T., Zou, Y., Kruse, A. C., Chung, K. Y., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Chae, P. S., Pardon, E., Calinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal++structure+of+the+&#946;2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex.">Crystal structure of the &#946;2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li><li>Rosenbaum, D. M., Cherezov, V., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Yao, X. J., Weis, W. I., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+engineering+yields+high-resolution+structural+insights+into+beta2-adrenergic+receptor+function.">GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptor function.</a> Science. 318, 1266-1273 (2007).</li><li>Rosenbaum, D. M., Zhang, C., Lyons, J. A., Holl, R., Aragao, D., Arlow, D. H., Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Devree, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+an+irreversible+agonist-beta(2)+adrenoceptor+complex.">Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex.</a> Nature. 469, 236-240 (2011).</li><li>Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G. W., Kobayashi, T., Setvens, R. C., Iwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+histamine+H1+receptor+complex+with+doxepin.">Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin.</a> Nature. 475, 65-70 (2011).</li><li>Thompson, A. A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., We, H., Vardy, E., Huang, X. P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B. L., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+nociceptin/orphanin+FQ+receptor+in+complex+with+a+peptide+mimetic.">Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic.</a> Nature. 485, 395-399 (2012).</li><li>Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V., Abagyan, R., Brooun, A., Wells, P., Bi, F. C., Hamel, D. J., Kuhn, P., Handel, T. M., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+CXCR4+Chemokine+GPCR+with+Small-Molecule+and+Cyclic+Peptide+Antagonists.">Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li><li>Wu, H., Wacker, D., Mileni, M., Katritch, V., Han, G. W., Vardy, E., Liu, W., Thompson, A. A., Huang, X. P., Carroll, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+kappa-opioid+receptor+in+complex+with+JDTic.">Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic.</a> Nature. 485, 327-332 (2012).</li><li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs,+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets.">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins.">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).</li><li>W&#246;hri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Lipidic-Sponge+Phase+Screen+for+Membrane+Protein+Crystallization.">A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization.</a> Structure. 16, 1003-1009 (2008).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rastering+strategy+for+screening+and+centring+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+microm+size+X-ray+synchrotron.">Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron.</a> 6, 587-597 (2009).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipid's+eye+view+of+membrane+protein+crystallization+in+mesophases.">A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).</li><li>Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temperature-composition+phase+diagram+and+mesophase+structure+characterization+of+the+monoolein/water+system.">The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system.</a> J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+lipid+for+membrane+protein+crystallization.">Rational design of lipid for membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).</li><li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+Membrane+Proteins+for+Structure+Determination+using+Lipidic+Mesophases.">Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. , e1712 (2010).</li><li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophase.">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase.</a> J. Vis. Exp. , e4000 (2012).</li><li>Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+insights+into+electron+transfer+in+caa(3)-type+cytochrome+oxidase.">Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase.</a> Nature. 10, (2012).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

I denna video artikeln vi visat hur kristaller odlas i en lipidisk mesofas skördas och kryo-kylda som förberedelse för användning i diffraktion datainsamling och slutligen för strukturbestämning. Den webbhotell mesofas kan vara viskösa och klibbiga kubiska fasen eller mer flytande svamp fas 4. Hur glaset sandwich plattorna öppnas och hur kristallerna skördas beror mycket på mesofas typ. Det är därför viktigt att veta vilken av de två man har att göra med i förväg. Den identitet värd lipid och fällningsmedel som används är viktiga i detta avseende, och den fysiska utseende mesofas bolus i kristallisationen väl kan användas för att skilja dem åt (Figur 3). Skörd från båda mesofas typerna illustrerades i denna artikel. Skörd små kristaller från en lipidisk mesofas i plattor av glas sandwich är ett mödosamt process som kräver tid, skicklighet, expertisience, tålamod och en stadig hand. Det är viktigt att avsätta en lämplig tid för skörd och att inrätta laboratoriet så att alla förnödenheter och utrustning finns på plats i förväg. En andra person att hjälpa till med skörden är inte nödvändigt men rekommenderas. Denna person kan hjälpa till med att leverera i förväg markerade plattor till individen gör skörd samt placera kryo-kylda monterade slingor med skördade kristaller i lagring pucken. Assistenten kan också spela en viktig stödjande roll för att dokumentera synpunkter på kristallerna som gjorts under skörd som kan visa sig avgörande vid diffraktion datainsamling. I avsaknad av en assistent, skulle en röstaktiverad ljud-inspelningsenhet med fördel användas för dokumentation. Efter det protokoll som beskrivs i denna artikel kommer att hjälpa att få Viewer igång med kristall skörd. Det är emellertid viktigt att inse att processen är inte okomplicerad och att practice behövs innan uppskjutning i skörd värdefulla kristaller membranprotein. Det rekommenderas därför att testa plattor med kristaller av proteiner som inte är särskilt värdefulla att experimenterat med först. Detta kommer att ge neofyten med värdefull erfarenhet inom skärande glas, ta bort glas skärvor, lyfta upp täckglas från över mesofasen med hjälp av polariserande funktionen på mikroskopet för att se kristaller och att spåra dem under skörd, och slutligen hantera olika typer av mesofaser och skörd av dem. Texturen av mesofas, och i förlängningen den lätthet med vilken kristaller kan skördas, kommer att förändras med tiden under kristallisation. Det är därför viktigt att öva skörd med mindre värdefulla kristaller men med dem som har vuxit under samma förhållanden som de mer värdefulla. Det är möjligt att odla kristaller av lysozym och taumatin av i meso eller lipidisk kubisk fas metod 28 och dessa bör beaktastas av sätt att få kännedom om material och metod. Man bör också överväga att arbeta med protein-fri mesofas först lära av sina nycker. De förfaranden visade här var alla gjort på ett bekvämt 20 ° C eller däromkring. Det är möjligt att odla kristaller av den i meso metoden vid lägre temperaturer. Sålunda, kan monoolein som värd lipiden i ett metastabilt fastillstånd användas vid 4 ° C 1,2,29,30. Ett alternativ är att använda rationellt utformade 7,9 MAG för låg temperatur kristallisation 31. Vi låg temperatur crysallogenesis rutinmässigt med vissa mål membranprotein. I detta fall är kristalltillväxt och skörd sker i en walk-in 4 ° C kylskåp. Att arbeta under sådana förhållanden har sina egna utmaningar inte minst som är behovet av varma och bekväm klädsel. Nästa steg i den övergripande processen för strukturbestämning med makromolekylära crystallography är att samla diffraktionsdata om kristaller skördas och snap-kyls såsom visas i den här artikeln. I meso-odlade kristaller är oftast små. Emellertid har användbar diffraktion datainsamling varit möjligt med kristaller med en maximal dimension av 20 pm 9. För detta ändamål är mikro-balk synkrotron röntgenstrålning används och är i fokus för en särskild JUPITER artikel i denna serie 32,33.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Komponenter </td></tr><tr><td> Böjda pincett </td><td> Sigma </td><td> F4142 </td><td> Verktyg </td></tr><tr><td> Disponibel pipettspetsar </td><td> Gilson </td><td> Olika </td><td> Disponibel </td></tr><tr><td> Skum dewar </td><td> Spearlab </td><td> FD-500 </td><td> Verktyg </td></tr><tr><td> Glas och metall avfallsbehållare </td><td> Daniels Healthcare </td><td> DD479OL </td><td> Verktyg </td></tr><tr><td> Skörd slingor </td><td> MiTeGen </td><td> Olika </td><td> Verktyg </td></tr><tr><td> Skörd mikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ1500 </td><td> Verktyg </td></tr><tr><td> Lab anteckningsbok </td><td> Olika </td><td> NA </td><td> Verktyg </td></tr><tr><td> Magnetisk tryckKnappen provladdning trollspö </td><td> Hampton Forskning / molekylära dimensioner </td><td> HR4-729/MD7-411 </td><td> Verktyg </td></tr><tr><td> Original Puck (för användning med ALS-stil robotar endast) </td><td> Crystal Positioning System </td><td> CP-111-035 </td><td> Verktyg </td></tr><tr><td> Pipetteringsanordningar </td><td> Gilson </td><td> Olika </td><td> Verktyg </td></tr><tr><td> Fällningsmedel lösningar </td><td> Olika </td><td> Olika </td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Puck Bent Cryo-Tong </td><td> Crystal Positioning System </td><td> CP-111-030 </td><td> Verktyg </td></tr><tr><td> Puck hyllan Frakt Cane (original ALS-stil) med krokig handtag och låsstång </td><td> Crystal Positioning System </td><td> CP-111-029 </td><td> Verktyg </td></tr><tr><td> Renat vatten </td><td> Millipore </td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Skyddsglasögon </td><td&gt; Various </td><td> NA </td><td> Verktyg </td></tr><tr><td> Exempel stiftbaserna - Magnetisk (icke-koppar) </td><td> Crystal Positioning System </td><td> CP-111-015 </td><td> Verktyg </td></tr><tr><td> Frakt dewar </td><td> Taylor-Wharton </td><td> CX100 </td><td> Verktyg </td></tr><tr><td> Vävnader </td><td> NA </td><td> NA </td><td> Disponibel </td></tr><tr><td> Volfram-karbid glas fräs (TCT Scriber) </td><td> Silverline Verktyg (Yeovil, Storbritannien) </td><td> 633.657 </td><td> Verktyg </td></tr></tbody></table>

harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography

En viktig väg för att förstå hur proteiner fungerar på en mekanistisk nivå är att ha strukturen av målproteinet finns, helst på atomär upplösning. För närvarande finns det bara ett sätt att fånga sådan information som tillämpas för integrala membranproteiner (figur 1), och komplexen som de bildar, och att metoden är makromolekylär röntgenkristallografi (MX). För att göra MX diffraktion kvalitet kristaller behövs, vilket i fallet med membranproteiner, bildar inte lätt. En metod för att kristallisera membranproteiner som innefattar användning av lipida mesofaser, särskilt de kubiska och svamp faser 1-5, har fått stor uppmärksamhet på senare tid på grund av de framgångar man haft i G-protein-kopplade receptorer fält 6-21 ( <a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www . mpdb.tcd.ie</a> ). Den metod, hädanefter kallad i meso eller lipidisk kubisk fas metoden kommer med sin egen tekniskautmaningar. Dessa uppkommer, delvis på grund av den allmänt viskösa och klibbiga natur lipidiska mesofas i vilken kristallerna, som ofta mikro-kristaller, växa. Manipulera kristaller blir svårt på grund och i synnerhet så under skörd 22,23. Problem uppstår också vid steget som föregår skörden som kräver att glaset sandwich plattor där kristallerna växer (Figur 2) 24,25 öppnas för att exponera mesofasen bolus och kristallerna däri, för skörd, kryo-kylning och eventuella X -diffraktion datainsamling. Den kubiska och svamp mesofas varianter (Figur 3) som kristaller måste skördas ha djupgående olika reologier 4,26. Den kubiska fasen är viskös och klibbig besläktad med en tjock tandkräm. Däremot är svampen fasen mer vätska med en distinkt tendens att flyta. Följaktligen olika metoder för att öppna kristallisation brunnar containing kristaller växer i kubik och svampen fasen kallas så verkligen olika metoder krävs för att skörda kristaller från de två mesofas typer. Protokoll för just detta har förfinats och genomförts i membranet strukturell och funktionell biologi (MS &amp; FB) koncernen och beskrivs i detalj i denna JUPITER artikeln (Figur 4). Exempel ges på situationer där kristaller framgångsrikt skördas och kryo-kylda. Vi erbjuder också exempel på fall där problem uppstår som leder till oersättlig förlust av kristaller och beskriva hur dessa problem kan undvikas. I denna artikel bildvisaren är försedd med steg-för-steg-instruktioner för att öppna glas brunnar sandwich kristallisation, för skörd och kryo-kylning kristaller av membranproteiner växer i kubisk och svamp faser.

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography at JoVE.co

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Häri beskrivs förfaranden som genomförs inom Caffrey Membrane strukturell och funktionell biologi koncernen att skörda och kryo-cool kristaller membranprotein odlas i lipidiska kubiska och svamp faser för användning i strukturbestämning med makromolekylär röntgenkristallografi.

Avverkning och Cryo-kylning Kristaller av membranproteiner som odlas i lipida mesofaser för strukturbestämning genom Makromolekylär kristallografi

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliserande Membrane proteiner för strukturbestämning med Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Betydelsen av korrekt proteinkoncentration för kinetik och affinitet Bestämning i struktur och funktion Analys

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Bedöma Tvådimensionella Kristallisering Trials of Small Membrane proteiner för strukturbiologi studier av elektron Kristallografi

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Kristallisering av membranproteiner i Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Hög genomströmning Kristallisering av membranproteiner Använda Lipidic Bicelle Metod

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Användning av en robot för hög kapacitet Kristallisering av membranproteiner i lipidisk mesofaser

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital Mikroskopi för Imaging subcellulära strukturer i levande möss som uttrycker fluorescerande proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Immunodetektering av yttermembranproteiner med flödescytometri av isolerat Mitokondrier

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...