Name: detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)
Uploaded: 2012-05-05T14:00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH at JoVE.com

الكتاب أشكر أعضاء في الماضي والحاضر من مختبر للمساهمات في تطوير منهجية المبينة هنا وآلان كوكرين للحصول على المشورة. لوس انجليس هي المستفيدة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) زمالة الدكتوراه وAJM معتمد من قبل جائزة شهادة فريزر، Monat وماكفيرسون. ويدعم هذا العمل عن طريق منحة من CIHR (منحة # MOP-56974).

<ol>
	<li>Lehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+transport+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomic+RNA+and+viral+production+are+dependent+on+dynein+motor+function+and+late+endosome+positioning.">Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning.</a> J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).</li><li>Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+mRNA+interactions+with+RNA+granules+during+translation+initiation+inhibition.">Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition.</a> PLoS One. 6, e19727 (2011).</li><li>Abrahamyan, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Staufen1+ribonucleoproteins+prevent+formation+of+stress+granules+but+favour+encapsidation+of+HIV-1+genomic+RNA.">Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA.</a> J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).</li><li>Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+visualization+of+the+interactions+between+HIV-1+Gag+and+the+cellular+RNA-binding+protein+Staufen1.">Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1.</a> Retrovirology. 7, 41-41 (2010).</li><li>Vercruysse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cooperative+Rev+protein-protein+interactions+on+Rev+responsive+RNA+by+fluorescence+resonance+energy+transfer.">Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer.</a> RNA Biol. 8, 316-324 (2011).</li><li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+mRNA+export:+insights+from+virology.">Nuclear mRNA export: insights from virology.</a> Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).</li><li>Cmarko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rev+inhibition+strongly+affects+intracellular+distribution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNAs.">Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs.</a> J Virol. 76, 10473-10484 (2002).</li><li>Ajamian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+roles+for+UPF1+in+HIV-1+RNA+metabolism+and+translation.">Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation.</a> RNA. 14, 914-927 (2008).</li><li>Beriault, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+late+role+for+the+association+of+hnRNP+A2+with+the+HIV-1+hnRNP+A2+response+elements+in+genomic+RNA,+Gag,+and+Vpr+localization.">A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization.</a> J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).</li><li>Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+remodels+the+nuclear+pore+complex.">HIV-1 remodels the nuclear pore complex.</a> J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).</li><li>Jordens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rab7+effector+protein+RILP+controls+lysosomal+transport+by+inducing+the+recruitment+of+dynein-dynactin+motors.">The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors.</a> Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).</li><li>Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+imaging+reveals+a+peroxisomal+reticulum+in+living+cells.">Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).</li><li>Levesque, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+HIV-1+RNA+is+mediated+by+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A2+expression+and+impacts+on+viral+assembly.">Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly.</a> Traffic. 7, 1177-1193 (2006).</li><li>Rocha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+sensor+ORP1L+contacts+the+ER+protein+VAP+to+control+Rab7-RILP-p150+Glued+and+late+endosome+positioning.">Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning.</a> J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).</li><li>Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Rev+function+by+a+dominant-negative+mutant+of+Sam68+through+sequestration+of+unspliced+RNA+at+perinuclear+bundles.">Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles.</a> J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).</li><li>Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hRIP,+a+cellular+cofactor+for+Rev+function,+promotes+release+of+HIV+RNAs+from+the+perinuclear+region.">hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region.</a> Genes Dev. 18, 23-34 (2004).</li><li>Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+induces+the+cytoplasmic+retention+of+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A1+by+disrupting+nuclear+import:+implications+for+HIV-1+gene+expression.">Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression.</a> J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).</li><li>Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+rev+trans-activator+acts+through+a+structured+target+sequence+to+activate+nuclear+export+of+unspliced+viral+mRNA.">The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA.</a> Nature. 338, 254-257 (1989).</li><li>Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+destinies:+degradation,+targeting,+assembly,+and+endocytosis+of+HIV+Gag.">Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag.</a> AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).</li><li>Molle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+trafficking+of+HIV-1+gag+and+genomic+RNAs+regulates+viral+egress.">Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress.</a> J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+coimaging+of+the+genomic+RNAs+and+Gag+proteins+of+two+lentiviruses.">Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses.</a> J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li><li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions.">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

FISH / إذا شارك في تحليل هو طريقة يمكن الاعتماد عليها لتصور RNA فيروسي في الخلايا التي تم الآن صقلها 9،15،16. على مدى عدة سنوات، قمنا بتطوير أسلوب راق في تلطيخ عن الحمض النووي الريبي. ويمكن استخدام هذه التقنية في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا المقدمة وهذا التحقيق هو محدد لهدف الجيش الملكي النيبالي 17. وذلك عبر تسمية لجنة التحقيق مع مجموعة دبي للاستثمار، ونحن قادرون على تصور بواسطة الحمض النووي الريبي تلطيخ بسيط. عندما يتم الجمع بين تلطيخ عن الحمض النووي الريبي والبروتينات الأخرى، FISH / إذا شارك في تحليل تصبح أداة قوية لمراقبة الهياكل الخلوية وتوطين بروتين / الحمض النووي الريبي. خصوصية الكشف عن الحمض النووي الريبي عالية جدا. ويتضح هذا في الشكل 2. في بعض الأعمال الأصلية التي تركز على الفيروس الجيني RNA الترجمة، والأسماك المنشأة أن عدم وجود رؤيا المحاصرين RNA الفيروسي في نواة 18. منذ هذا، وقد تم الحصول على معلومات جديدة وفيرة في الجينوم الفيروسي RNA الترجمة باستخدام الاسلوبورد ه هنا. بواسطة البروتينات الخلوية overexpressing، يمكن أن تضطر السكان ومحددة ليس كل من الحمض النووي الريبي الفيروسي في توطين إلى مناطق مختلفة من الخلية. حصلت RILP overexpression، الذي يشبه النمط الظاهري عندما يتم استنفاد hnRNP A2 بواسطة سيرنا في HIV-1-معربا عن الخلايا 13، يؤدي إلى تراكم الحمض النووي الريبي واضح في MTOC. ويمكن دفع الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي على هامش الخلية عن طريق تعطيل بروتين المحركات ناقص النهائيين، داينين: overexpression p50/Dynamitin أو ضربة قاضية لالثقيلة النتائج داينين ​​1 سلسلة في الإفراج عن الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي من المجالات بين الخلايا لهامش الخلوية ( الشكل 2). متحولة من RILP، RILPΔN، التي لم تعد تربط محرك داينين، يشتت الإندوسومات (الموسومة بواسطة LAMP1) إلى السيتوبلازم لأنها لم تعد بنشاط ممركزة في المجالات juxtanuclear. هذه النتائج تشير الى فكرة وجود سكان من البلاستيك HIV-1 الحمض النووي الريبي الجينومية وعلى وجه الخصوص، أن مختلف برك من الجينومية-1 فيروس نقص المناعة البشريةالجيش الملكي النيبالي موجودة مع أدوار محددة في بعض الأحيان في دورة تكاثر الفيروس. وقد تم بالفعل هذه الأفكار نفسها التي حددت لهذا البروتين المشفرة بواسطة مرنا، الكمامة 19. هناك قيود على استخدامات FISH / إذا شارك في التحليلات التي ترتبط خيار الأجسام المضادة ومدى توافرها. والاستفادة المثلى من أفضل مزيج من الاجسام المضادة الابتدائية والثانوية، وتركيزاتها، يستغرق وقتا طويلا لتحسين (أنظر الجدول رقم 1 و 2). يمكن أن الأجسام المضادة التي من hybridomas أو التي تنتجها الشركات الكبرى لديها تركيزات التي تختلف في أي مكان من 01:02 إلى 1:2000، ولكن يجب التأكد من اتباع الإرشادات المقدمة من قبل الشركة المصنعة للحصول على أفضل النتائج. ويجب أيضا المضيف الذي يتم انتاجه في الجسم المضاد يؤخذ قيد النظر. وينبغي أيضا الأغنام الاختلاط مع الأجسام المضادة الماعز يمكن تجنبها في الأجسام المضادة الأولية والثانوية مثل هذه النتائج في مجموعة خلفية عالية نظرا لعبور الأنواع اعتراف (لا تظهر البيانات). لاليكسا، فلور secondaالأجسام المضادة راي، يمكن استخدام تركيز على الأجسام المضادة لل1:500 أي تقريبا في المجموعة. والعيب الآخر لصيد السمك / إذا شارك في التحليلات على النحو المبين في هذا التقرير هو أنه يلتقط الجيش الملكي النيبالي في موقعه في الدولة، ثابت، بعد أن يتم إصلاح الخلايا وpermeabilized باستخدام امتصاص العرق والمنظفات (الشكل 1). ومع ذلك، فقد تم تحقيق RNA التصوير في الخلايا الحية من خلال مجموعة متنوعة من الوسائل 20-22، معظمها باستخدام أشكال مختلفة من الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي الذي يتم تمييزها من البروتينات الفلورية مثل GFP. ومع ذلك، وسائل إضافية لتحديد الحمض النووي الريبي التوطين في الخلايا الحية لا تزال تطفو على السطح. هذه الطرق الجديدة تنطوي على الحمض النووي الريبي عن طريق وضع علامات السبانخ 23، SNAP 24، أو MTRIP 2. هذه التقنيات أيضا يعانون من عدد قليل من العيوب بما في ذلك شرط لpermeabilize الخلايا قبل ان يضيف ركائز أو على وجوب هندسيا شاردة لوضع علامة على مرنا من أجل الكشف عن مرنا بواسطة المجهر. في الواقع، وأدفا الرئيسيةntage التحليلات الأسماك الواردة في هذا التقرير تكمن في حقيقة أن الحمض النووي الريبي الأم هي دون تغيير مما يؤدي إلى نتائج أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> 18mm coverslips </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16٪ لامتصاص العرق </td><td> JT بيكر </td><td> S898-07 </td><td> لجعل 4٪: ذوب 20G في 1XDPBS 500mL على 60 درجة مئوية مع هيدروكسيد الصوديوم قطرات 5. درجة الحموضة إلى 7.2 قبالة الحرارة وتخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. لا تتجاوز 70 درجة مئوية! </td></tr><tr><td> تريتون-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> الدقيقة استخراج جل أزل كيت </td><td> روش </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA وسمها ميكس </td><td> روش </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> البوليميراز النسخ T7 RNA </td><td> إينفيتروجن </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> أعمدة الدوران السريع </td><td> روش </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> أنا الدناز </td><td> إينفيتروجن </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS 1X </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> الحمض الريبي النووي النقال </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> ريبونوكلياز OUT </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> تعيين فلوري محسن الجسم المضاد للكشف DIG # 4 (حل الحجب) </td><td> روش </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> اليكسا فلور الأجسام المضادة الثانوية </td><td> إينفيتروجن </td><td> انظر الجدول رقم 2 </td><td></td></tr><tr><td> تهجين فرن </td><td> Boekel الخيال العلميentific </td><td> نموذج 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Microslides </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول رقم 1. تحديد الكواشف محددة والمعدات <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الأنواع المضادة للأجسام المضادة DIG (تخفيف؛ عدد كتالوج الشركة،) </td><td> الألوان </td><td> اليكسا فلور استخداما (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> الماوس (1:500، سيغما، B7405) </td><td> أخضر </td><td> اليكسا فلور 488 حمار لمكافحة فأر (إينفيتروجن، A21202) </td></tr><tr><td> أحمر </td><td> اليكسا فلور 594 حمار لمكافحة فأر (إينفيتروجن، A21203) </td></tr><tr><td> أزرق </td><td> اليكسا فلور 647 حمار لمكافحة فأر (إينفيتروجن، A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> خروف (1:200، روش، 11376623) </td><td> أخضر </td><td> اليكسا فلور 488 حمار المضادة للغنم (إينفيتروجن، A11015) </td></tr><tr><td> أحمر </td><td> اليكسا فلور 594 حمار المضادة للغنم (إينفيتروجن، A11016) </td></tr><tr><td> أزرق </td><td> اليكسا فلور 647 حمار المضادة للغنم (إينفيتروجن، A21448) </td></tr></tbody></table> الجدول 2. مجموعات من الأجسام المضادة الثانوية والمضادة DIG المدرجة مع أرقام التسويقي وتركيزات.

detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH at JoVE.com

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

ومضان<em&gt; في الموقع</emوقد وضعت&gt; تهجين (FISH) طريقة للكشف عن الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي بصريا باستخدام المجهر مضان. يتم إجراء تحقيق مع خصوصية لRNA فيروسي ومن ثم يمكن تحديدها باستخدام مزيج من تقنيات التهجين والمناعي. هذه التقنية توفر ميزة التعرف على توطين RNA فيروسي أو الحمض النووي في الدولة ثابتة، وتوفير المعلومات بشأن التحكم في الخلايا أحداث الاتجار فيروس.

الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

مضان في الموقع التهجين (FISH) البروتوكول في الحيوانات المنوية البشرية

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

تحليل النسخ الجيني وحيدة الخلية التي كتبها نيون RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

كله جبل RNA نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين في الأجنة جبل الجامعة وعلم الأنسجة الخلية مقتبس عن Elasmobranchs البحرية

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

الحمض النووي RNA-مجتمعة نيون<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; التهجين (FISH) لدراسة كروموسوم X التعطيل في المتباينة أنثى الفأر الخلايا الجذعية الجنينية

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

خيارات نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; بروتوكول التهجين لXist RNA جنبا إلى جنب مع المناعي من هيستون تعديل في كروموسوم X-التعطيل

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

طريقة بسيطة لDNA الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لسحق الكروموسومات

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

الكشف عن البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي<em&gt; في المختبر</em&gt; RNA المنسدلة في خلية شحمية الثقافة

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...