Name: detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)
Uploaded: 2012-05-05T14:00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH at JoVE.com

Forfatterne takker tidligere og nuværende medlemmer af laboratoriet for bidrag til udviklingen af ​​metoden skitseret her og Alan Cochrane for at få råd. LA er en modtager af en canadisk Institutes of Health Research (CIHR) Ph.d. Fellowship og AJM understøttes af et Fraser, Monat og MacPherson Career Award. Dette arbejde understøttes af en bevilling fra CIHR (tilskud # MOP-56.974).

1. Probe Forberedelse <ol><li> Fordøjelse 1 ug af in vitro transcription vektoren pKS (+) pol 236nt 9 med Kpn1 enzym ved 37 ° C i 1 time og køre det lineariserede DNA-produkt på en agarosegel. Fragmentet bør være ca 2500 bp. </li><li> Skar fragmentet ud af gelen og renses under anvendelse af Roche Micro Eluer Gel Extraction Kit (alle reagenser er anført i tabel 1). Udføre den endelige eluering i 30 pi elueringsbuffer. Forsøg 5 ul af produktet på en agarosegel for at verificere oprensning. </li><li> Blande en in vitro transkriptionsreaktion (se opskrift nedenfor) under anvendelse af Roche DIG RNA labelling kit og inkuber ved 37 ° C i 2 timer. </li></ol> In vitro transcription reaktionen: <table border="1"><tbody><tr><td> Lineariserede DNA </td><td> 23 gl </td></tr><tr><td> 1X DIG RNA mærkning mix (Roche) </td><td> 4 gl </td></tr><tr><td> 1X Transcription buffer </td><td> 8 pi </td></tr><tr><td> 20 U RNase OUT </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> 80U T7 RNA-polymerase </td><td> 4 gl </td></tr><tr><td> Total </td><td> 40 pi </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Tilsættes 228 U af DNase I og inkuber ved 37 ° C i 15 min. </li><li> Reaktionen standses ved tilsætning af EDTA, pH 8,0 til en slutkoncentration på 20 mM. </li><li> Rense reaktionen ved anvendelse af Quick Spin Columns fra Roche som specificeret af fabrikanten. </li><li> Oprense probe ved udfældning med 1/10 volumen DEPC-behandlet 3M NaOAc pH 5,2 og 2,5 volumener af iskold 95% ethanol. Bland og inkuber ved -80 ° C i 30 minutter til natten over. </li><li> Centrifugeres proben i 15 minutter ved 4 ° C ved 15.000 x g. </li><li> Fjern supernatanten og vask centrifugebundfaldet i iskold 70% ethanol. Centrifugeres igen i 5 minutter ved 4 ° C ved 15.000 x g. </li><li> Fjern supernatanten og tørring af pellet. Pellet resuspenderes i 50 pi water (DNase / RNase gratis) indeholdende 10 U Invitrogen RNase OUT. </li><li> Estimere koncentrationen af ​​probe ved spektrofotometri (foranstaltning RNA ved 260 nm), og fortyndes til en koncentration på 5 ng / gl. Opbevares i portioner ved -20 ° C til kortvarig brug, eller -80 ° C for langtidsopbevaring. Det anbefales at udføre blandt assay sammenligning så bevare en alikvot af denne. </li></ol> 2. Cellefiksering <ol><li> Det er først vigtigt at frø adhærente celler på ubehandlede, sterile dækglas så den endelige konfluens ved høst er cirka 70-80%. For ikke-adhærente celler, vokser som normalt og når de er klar til at indsamle, inkubere dem med dækglas, der er blevet behandlet med 0,01% w / v poly-L-lysin (Sigma-Aldrich, Inc.) i 1 time. For en typisk 12-brønds polystyren vævskulturplade (3,8 cm2), er 150.000 celler (f.eks HeLa) udpladet på 24 timer før transfektion. Ikke-adhærente celler kan inficeres eller transficeres som sædvanligt og fik lov at adher for at dækglas før fiksering 3. </li><li> Kassere medier og vask af cellerne med 1X phosphatpufret saltopløsning fremstillet i dobbeltdestilleret vand (DPBS) i 1 min. Diethylpyrocarbonat (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc.)-behandlede 1X PBS kan også anvendes, kan imidlertid ubehandlet PBS ikke så den kan indeholde RNase enzymer. </li><li> Kassér PBS, og der tilsættes 4% paraformaldehyd, nok til at dække cellerne fuldstændigt. Inkuber i 15-20 min. </li><li> Kassér paraformaldeyhyde og vask celler med 1X DPBS for 1 min. </li><li> Kassere DPBS, og der tilsættes 0,1 M glycin (opløst i 1X DPBS). Inkuber i 10 min. </li><li> Kassér glycin og vaskes cellerne med 1X DPBS i 1 min. </li><li> Kassere DPBS, og der tilsættes 0,2% Triton-X (opløst i 1X DPBS). Inkuber i 5-10 min. Hvis farvning for nucleolar eller nuklear kappeproteiner, permeabilisere med Triton X-100 for ikke mere end 5 minutter eller protein lokalisering bliver diffust. </li><li> Skille Triton X-100 og vaskes en gang i1X DPBS i 1 min. </li><li> For lang tids opbevaring, erstatte PBS med 70% ethanol og opbevares ved 4 ° C i op til fire måneder. Alternativt vaskes en gang mere med 1X DPBS og begynde at fiske. </li></ol> 3. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) <ol><li> Hvis dækglas blev opbevaret i ethanol, erstatte ethanol med 1X DPBS og tillade cellerne at rehydratisere i 30 minutter. Rehydrering kan gøres natten over, hvis dækglassene opbevares ved 4 ° C. </li><li> Vaskes dækglassene med 1X DPBS i 1 min. </li><li> Forbered dias at inkubere dækglassene om, at tage sig at rense og mærke dem godt. </li><li> For en 18mm dækglas, tilsættes 50 ul DNase opløsning (25 enheder / dækglas kommercielt tilgængelige) til dias. Tilsæt dækglasset, er sikker på at placere den celle nedad, og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Vaskes dækglassene med 1X DPBS i 1 min. </li><li> Tilsæt 50 ul hybridiseringsblanding (se opskrift nedenfor) pr dækglas pået objektglas og inkuberes dækglasset cellen nedad i 16-18 timer ved 42 ° C. Inkuberingen skal udføres i en bakke indeholdende en 50% formamid, 2X SSPE blanding (12,5 ml deioniseret formamid, 2,5 ml 20X SSPE, 10 ml vand). </li></ol> Hybridisering Mix (et dækglas, 50 ul): <table border="1"><tbody><tr><td> Beløb på lager </td><td> Materiale (ved slutkoncentration) </td></tr><tr><td> 25 ul </td><td> Formamid, 50% (deioniseret; enhver kilde) </td></tr><tr><td> 5 ul (10 mg / ml) </td><td> tRNA, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc.) </td></tr><tr><td> 5 ul (20 x) </td><td> SSPE, 2X </td></tr><tr><td> 5 ul (i 50X) </td><td> Denharts, 5X </td></tr><tr><td> 0,125 pi (af 5 enheder) </td><td> RNase OUT </td></tr><tr><td> 5 ul (25 ng af 5 ng / gl) </td><td> Probe </td></tr><tr><td> 5 ul </td><td> H2O DEPC, at den endeligevolumen 50 ul </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> Inkuber dækglas celle nedad i 50 pi 50% formamid (fortyndet i 1X DPBS) i 15 minutter ved 42 ° C. </li><li> Vaskes dækglassene to gange i 2X SSPE ved at inkubere dem celle nedad i 50 pi 2 x SSPE (20X SSPE fortyndet i 1X DPBS) i 5 minutter hver ved 42 ° C. </li><li> Vaskes dækglassene i 1X DPBS i 1 min. </li></ol> 4. Immunfluorescensfarvning <ol><li> Blokere dækglas ved at placere dem celle nedad i 50 pi 1X Roche blokerende opløsning (10X Roche blokerende opløsning fortyndet i 1X DPBS) i 30 min. </li><li> Inkubér dækglas cellen nedad i 50 pi primære antistof-opløsning i 1 time ved 37 ° C. Anti-DIG-antistof skal fortyndes ifølge producentens instruktioner i 1X blokerende opløsning. Hvis andre antistoffer anvendes til at farve proteiner, kan de tilsættes i den korrekte koncentration, forudsat at alle anvendte antistoffer er afledt af forskellige vært specerne. </li><li> Vaskes dækglassene i 10 minutter i 1X DPBS. </li><li> Inkubér dækglas cellen nedad i 50 pi sekundært antistof opløsning i 1 time ved 37 ° C. Alexa Fluor-konjugerede antistoffer (Invitrogen) kan anvendes til at generere en række af farver og anvendes på 1:500 i 1X blokerende opløsning, 1X DPBS. </li><li> Vaskes dækglassene to gange i 10 minutter hver i 1 x DPBS. </li><li> Tør dækglas cellen opad på Whatman papir. Sørg for at dække dækglassene at undgå udsættelse for lys og blegning. </li><li> Når al væske er fordampet, montere dækglassene på friske dias med 8 gl ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc.). Forsigtigt trykke ned dækglasset at fjerne eventuelle luftbobler. </li><li> Anvendelse neglelak til kanterne af dækglasset for at fastgøre det på plads. </li><li> Visualiseringen af ​​RNA og proteiner ved hjælp af mikroskopi teknikker er også afgørende for succes i denne teknik. Indstillinger på den anvendte mikroskop kan hjælpe eller hindre visualisering, så det er afgørende, at denindstillinger på mikroskopet skal indstilles korrekt og være konsekvent fra den ene prøve til den anden i et givet eksperiment. For detaljerede mikroskopi indstillinger, du optik og antistof kombinationer se referencer 1,10. </li></ol> 5. Repræsentative resultater Et eksempel på viral RNA-farvning, kan ses i figur 2. Det virale RNA til HIV-1 set hele cytoplasmaet vist diffust for det meste, men lille cytoplasma punctae ikke er ualmindelige. Specificiteten kan ses ved at sammenligne positive celler omgivende celler, der udviser nogen fluorescens. Som nævnt i indledningen, HIV-1, der mangler den regulerende Rev proteinet produceres RNA, som er tilbageholdt i kernen: Dette kan visualiseres som et lyst signal i kernen, og en mangel på RNA fluorescenssignal i cytoplasmaet. Overekspression af cellulære proteiner er også i stand til forskydning af fordelingen af ​​HIV-1 viralt RNA. I figur 2 </stærk&gt;, overekspression af proteiner involveret i endosomale vesikel handel (f.eks Rab7-interagerende lysosomalt protein (RILP) 11 eller N-terminalt udgår RILP (RILPN) 11, og proteiner, som interfererer med dynein motorisk funktion [fx p50/dynamitin 1, 12], interfererer med den normale steady-state lokalisering af viralt genomisk RNA, som bestemt ved FISH analyser RILP ekspression fører til re-lokalisering af det virale genomiske RNA til mikrotubulus organisationen midten (MTOC) 13;. RILPN dispergerer sen endosomer efter cytoplasma på grund af den manglende evne til at binde til p150 Limet på dynein motoren komplekset 14 og p50/dynamitin blokerer den store underenhed af dynein motor og frigiver sene endosomer, men også den virale genomiske RNA og HIV-1-strukturelle proteiner i cellen periferien 1 (figur 2). manipulation af steady-state lokalisering af det virale genomiske RNA, en vigtig bidragyder til infektivitetviruspartikler, ville være nøglen til eventuel udvikling af terapeutiske midler. I vores hænder, vises viral RNA i cellen så tidligt som 3 timer efter transfektion og infektion 10 og bliver let ses af denne FISH teknik ved 12 timer. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> Figur 1. Flow diagram af protokollen for FISH / IF co-analyser. Cellerne dyrkes på dækglas og derefter fikseret med paraformaldehyd. Behandlinger af glycin og Triton-X udføres før cellerne enten anvendes til FISH / IF eller opbevaret i 70% ethanol til opbevaring. Celler dehydrerede til opbevaring er rehydreres i 1X DPBS (DEPC-behandlet PBS), før du går videre på FISH / IF. Celler behandlet med DNase I og efterladt natten over for at hybridisere med proben. Når hybridisering er fuldført, vaskes cellerne med formamid, såvel som med SSPE, og en afsluttende 1X DPBS skylning. Blokerende opløsning påføres til cellerne, efterfulgt af inkubering medde primære antistoffer. Efter vask sekundære antistoffer anvendes. To afsluttende vask i 1X DPBS afslutte farvningsproceduren, hvor på dækglassene tørres og monteret på objektglas til billeddannelse. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> Figur 2. Repræsentative resultater under anvendelse FISH / IF co-analyser. A) HIV-1 er transficeret ind i HeLa-celler og i nogle tilfælde med konstruktioner, som forårsager overekspression af cellulære proteiner (RILP, p50/Dynamitin og RILPΔN (en amino-terminal deletion mutant)) . FISH / IF co-analyser blev udført: RNA er identificeret i grøn med enten G3BP eller LAMP1 (rød) til at differentiere. B) HIV-1 udtrykkes i HeLa-og opsamlet på forskellige tidspunkter. Viral RNA udtryk spores i grønt, mens det cellulære protein, hnRNP A1, er plettet med rødt. Målestokbjælkerne er 10 um. Billeder modificerede fra henvisninger 1 (udvalgte tal fra panel A RILP, p50/Dynamitin, og RILP deltaN)og 17 (panel B).

<ol>
	<li>Lehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+transport+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomic+RNA+and+viral+production+are+dependent+on+dynein+motor+function+and+late+endosome+positioning.">Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning.</a> J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).</li><li>Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+mRNA+interactions+with+RNA+granules+during+translation+initiation+inhibition.">Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition.</a> PLoS One. 6, e19727 (2011).</li><li>Abrahamyan, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Staufen1+ribonucleoproteins+prevent+formation+of+stress+granules+but+favour+encapsidation+of+HIV-1+genomic+RNA.">Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA.</a> J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).</li><li>Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+visualization+of+the+interactions+between+HIV-1+Gag+and+the+cellular+RNA-binding+protein+Staufen1.">Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1.</a> Retrovirology. 7, 41-41 (2010).</li><li>Vercruysse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cooperative+Rev+protein-protein+interactions+on+Rev+responsive+RNA+by+fluorescence+resonance+energy+transfer.">Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer.</a> RNA Biol. 8, 316-324 (2011).</li><li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+mRNA+export:+insights+from+virology.">Nuclear mRNA export: insights from virology.</a> Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).</li><li>Cmarko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rev+inhibition+strongly+affects+intracellular+distribution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNAs.">Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs.</a> J Virol. 76, 10473-10484 (2002).</li><li>Ajamian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+roles+for+UPF1+in+HIV-1+RNA+metabolism+and+translation.">Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation.</a> RNA. 14, 914-927 (2008).</li><li>Beriault, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+late+role+for+the+association+of+hnRNP+A2+with+the+HIV-1+hnRNP+A2+response+elements+in+genomic+RNA,+Gag,+and+Vpr+localization.">A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization.</a> J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).</li><li>Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+remodels+the+nuclear+pore+complex.">HIV-1 remodels the nuclear pore complex.</a> J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).</li><li>Jordens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rab7+effector+protein+RILP+controls+lysosomal+transport+by+inducing+the+recruitment+of+dynein-dynactin+motors.">The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors.</a> Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).</li><li>Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+imaging+reveals+a+peroxisomal+reticulum+in+living+cells.">Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).</li><li>Levesque, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+HIV-1+RNA+is+mediated+by+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A2+expression+and+impacts+on+viral+assembly.">Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly.</a> Traffic. 7, 1177-1193 (2006).</li><li>Rocha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+sensor+ORP1L+contacts+the+ER+protein+VAP+to+control+Rab7-RILP-p150+Glued+and+late+endosome+positioning.">Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning.</a> J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).</li><li>Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Rev+function+by+a+dominant-negative+mutant+of+Sam68+through+sequestration+of+unspliced+RNA+at+perinuclear+bundles.">Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles.</a> J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).</li><li>Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hRIP,+a+cellular+cofactor+for+Rev+function,+promotes+release+of+HIV+RNAs+from+the+perinuclear+region.">hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region.</a> Genes Dev. 18, 23-34 (2004).</li><li>Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+induces+the+cytoplasmic+retention+of+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A1+by+disrupting+nuclear+import:+implications+for+HIV-1+gene+expression.">Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression.</a> J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).</li><li>Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+rev+trans-activator+acts+through+a+structured+target+sequence+to+activate+nuclear+export+of+unspliced+viral+mRNA.">The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA.</a> Nature. 338, 254-257 (1989).</li><li>Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+destinies:+degradation,+targeting,+assembly,+and+endocytosis+of+HIV+Gag.">Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag.</a> AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).</li><li>Molle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+trafficking+of+HIV-1+gag+and+genomic+RNAs+regulates+viral+egress.">Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress.</a> J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+coimaging+of+the+genomic+RNAs+and+Gag+proteins+of+two+lentiviruses.">Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses.</a> J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li><li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions.">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007 (2011).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

FISH / IF co-analyser er en pålidelig metode til at visualisere viralt RNA i celler, som nu er raffineret 9,15,16. I løbet af flere år, har vi udviklet en forbedret metode til farvning til RNA. Denne teknik kan anvendes på en lang række celletyper, forudsat at proben er specifik for mål-RNA&#39;et 17. Ved mærkning af sonden med DIG, er vi i stand til at visualisere de RNA ved simpel farvning. Ved farvning for RNA og andre proteiner er kombineret, FISH / IF co-analyser bliver et kraftfuldt værktøj til at observere cellulære strukturer og protein / RNA lokalisering. Specificiteten af ​​RNA detektion er ganske høj. Dette er illustreret i figur 2. I nogle af de oprindelige arbejde, der fokuserede på viral genomisk RNA lokalisering, FISH fastslået, at en manglende Rev fanget virale RNA i cellekernen 18. Da dette, har rigelig nye oplysninger om viral genomisk RNA lokalisering er opnået ved hjælp af technique skitseret her. Ved overekspression cellulære proteiner, kan specifikke populationer-og ikke alle af det virale RNA blive tvunget til at lokalisere forskellige områder af cellen. RILP overekspression, hvilket ligner fænotype opnås, når hnRNP A2 er forårsaget af siRNA i HIV-1-udtrykkende celler 13, bevirker RNA&#39;et til synligt akkumuleres ved MTOC. De virale genomiske RNA kan skubbes til cellen periferien ved at deaktivere minus-ende motor protein dynein: p50/Dynamitin overekspression eller knockdown af dynein tunge kæder 1 resulterer i frigivelse af viralt genomisk RNA fra intracellulære domæner til cellulære periferien ( figur 2). En mutant af RILP, RILPΔN, som ikke længere binder dynein motoren, dispergerer endosomer (mærket ved LAMP1) i cytoplasmaet, fordi de ikke længere aktivt lokaliseret ved juxtanuclear domæner. Disse resultater peger på begrebet plast population af HIV-1 genomiske RNA og i særdeleshed, at forskellige pools af HIV-1 genomiskeRNA eksisterer med undertiden identificerbare roller i den virale replikationscyklus. Disse samme begreber er allerede blevet identificeret for proteinet kodet af dette mRNA, Gag 19. Der er begrænsninger for brugen af ​​FISH / IF co-analyser, der er relateret til antistof valg og tilgængelighed. Optimering af den bedste kombination af primære og sekundære antistoffer, og deres koncentrationer, det tager tid at optimere (se tabel 1 og 2). Antistoffer fremstillet af hybridomer eller fremstillet af store virksomheder kan have koncentrationer, der varierer lige fra 1:2 til 1:2000, men sørg for at følge de retningslinjer, som producenten for de bedste resultater. Den vært, hvori antistoffet er fremstillet, skal også tages under overvejelse. Blanding får med gedeantistoffer bør også undgås i primære og sekundære antistoffer som denne kombination resulterer i høj baggrund på grund af kryds-art genkendelse (data ikke vist). For Alexa-Fluor Secondary antistoffer kan koncentrationen anvendes ved 1:500 til næsten ethvert antistof i sættet. Den anden ulempe ved at FISH / IF co-analyser som beskrevet i denne rapport er den indfanger den RNA ved sin beliggenhed ved steady-state, efter at cellerne er blevet rettet, og permeabiliseres med paraformaldehyd og opvaskemiddel (figur 1). Imidlertid har RNA billeddannelse i levende celler er blevet opnået ved en række midler 20-22, mest hjælp af forskellige former virale RNA genomer, der er mærket med fluorescerende proteiner, såsom GFP. Men yderligere midler til at identificere RNA lokalisering i levende celler fortsætter op til overfladen. Disse nye fremgangsmåder involverer mærkning RNA ved hjælp af spinat 23, SNAP 24 eller MTRIP 2. Disse teknikker lider også nogle ulemper, herunder kravet om at permeabilisere cellerne før tilsætning af substrater eller en del skal manipuleres til at kode mRNA for detektere mRNA ved mikroskopi. Faktisk er den største advantage af FISH analyser er beskrevet i denne rapport er, at det native RNA er uændret, der fører til de mest fysiologisk relevante resultater.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 18mm dækglas </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16% paraformaldehyd </td><td> JT Baker </td><td> S898-07 </td><td> At 4%: Opløs 20 g i 500 ml 1XDPBS ved 60 ° C med 5 dråber NaOH. pH til 7,2 af varmen og opbevares ved -20 ° C. Må ikke overstige 70 ° C! </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Eluer Gel Extraction Kit </td><td> Roche </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA Mærkning Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> Transkription T7 RNA-polymerase </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Quick Spin Columns </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNase OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescerende antistof Enhancer Sæt til DIG Detection # 4 (blokerende opløsning) </td><td> Roche </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor sekundære antistoffer </td><td> Invitrogen </td><td> Se tabel 2 </td><td></td></tr><tr><td> Hybridiseringsovn </td><td> Boekel Sciskabelig </td><td> Model 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Microslides </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Identificering af specifikke reagenser og udstyr <table border="1"><tbody><tr><td> Arter af anti-DIG-antistof (fortynding, firma, katalognummer) </td><td> Farver </td><td> Alexa Fluor anvendte (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Mus (1:500, Sigma, B7405) </td><td> grøn </td><td> Alexa Fluor 488 æsel-anti-muse (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> rød </td><td> Alexa Fluor 594 æsel-anti-muse (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> blå </td><td> Alexa Fluor 647 æsel-anti-muse (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Får (1:200, Roche, 11.376.623) </td><td> grøn </td><td> Alexa Fluor 488 æsel anti-får (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> rød </td><td> Alexa Fluor 594 æsel anti-får (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> blå </td><td> Alexa Fluor 647 æsel anti-får (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Kombinationer af sekundære antistoffer og anti-DIG angivet med katalognumre og koncentrationer.

detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)

Virus, der inficerer celler fremkalder specifikke ændringer normale cellefunktioner, der tjener til at aflede energi og midler til viral replikation. Mange aspekter af værtscellen funktion er beslaglagt af vira, sædvanligvis ved ekspressionen af ​​virale genprodukter, der rekrutterer værtscelleproteiner og machineries. Hertil kommer, at virus ingeniør specifikke membranreceptorer organeller eller tag i mobil vesikler og motoriske proteiner rettet områder af cellen (i de novo-infektion selvsupplering vira molekylære motor proteiner til at målrette kernen; senere under viruskonstruktion, vil de kapre cellulær machineries, der vil hjælpe i den samling af virus). Mindre forstås, hvordan vira, især med RNA genomer, koordinere intracellulære handel både protein og RNA-komponenter, og hvor de opnår samlingen af ​​infektiøse partikler ved specifikke loci i cellen. Undersøgelsen af ​​RNA lokalisering begyndte i tidligere arbejde. Udvikling lavere eukaryote emembryoner og neuronale celler forudsat vigtig biologisk information, og også understregede betydningen af ​​RNA lokalisering i planlægningen af ​​genekspression kaskader. Undersøgelsen i andre organismer og cellesystemer er givet tilsvarende vigtig information. Vira er obligate parasitter og skal udnytte deres værtsceller at kopiere. Det er således vigtigt at forstå, hvordan RNA-vira styre deres RNA genomer fra kernen gennem kerneporen gennem cytoplasmaet og videre til en af dens endelige bestemmelsessted, i afkommenes viruspartikler 1. FISH tjener som et nyttigt værktøj til at identificere ændringer i steady-state lokalisering af virale RNA. Når det kombineres med immunofluorescens (IF) analyse 22, FISH / IF co-analyser vil give oplysninger om co-lokalisering af proteiner med den virale RNA 3. Denne analyse giver derfor et godt udgangspunkt for at teste for RNA-protein interaktioner med andre biokemiske eller biofysisketests 4,5, da co-lokalisering i sig selv er ikke nok beviser til at være sikker på en interaktion. Ved at studere viral RNA lokalisering ved hjælp af en metode som dette, er store mængder af information opnået på både virale og cellulære RNA handel begivenheder 6. For eksempel producerer HIV-1 RNA i kernen af ​​inficerede celler, men RNA kun omsættes i cytoplasmaet. Når en tast viralt protein mangler (Rev) 7, har FISH af det virale RNA viste, at blokken til virusreplikation skyldes tilbageholdelse af HIV-1 genomiske RNA i kernen 8. Her præsenteres fremgangsmåden til visuel analyse af viralt genomisk RNA in situ. Fremgangsmåden gør brug af en mærket RNA-probe. Denne sonde er designet til at være et supplement til de virale genomiske RNA. Under in vitro-syntese af antisense RNA-probe, den ribonukleotid, som er modificeret med digoxigenin (DIG) er inkluderet i en in vitro transcription reaktion. Når proben er hybridiseret til mål-mRNA i celler, vil efterfølgende antistof mærkning trin (fig. 1) viser lokaliseringen af mRNA og proteiner af interesse i forbindelse med udførelsen FISH / IF.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH at JoVE.com

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

En fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH) fremgangsmåde blev udviklet til visuelt detektere viralt genomisk RNA ved hjælp af fluorescensmikroskopi. En probe fremstillet med specificitet for det virale RNA, som derefter kan identificeres ved anvendelse af en kombination af hybridisering og immunfluorescensteknikker. Denne teknik har den fordel at identificere lokaliseringen af ​​det virale RNA eller DNA ved steady-state, der giver oplysninger om kontrol af intracellulære virus menneskehandel begivenheder.

Påvisning af viralt RNA ved fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatin Isolering af RNA Oprensning (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analyse af enkeltcelle-gentransskription ved RNA Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Hele Mount RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering af<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoner

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering i Hele Mount Embryoner og Cell Histologi Tilpasset til Marine bruskfisk

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse af mRNA molekyler under anvendelse Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Kombineret DNA-RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH) til at studere X-kromosom inaktivering differentieret hunmus embryonale stamceller

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Quick Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering Protokol for Xist RNA Kombineret med Immunofluorescens af histon Ændring i X-kromosom Inaktivering

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Enkle metode til fluorescens DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering til mast kromosomer

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Påvisning af RNA-bindende proteiner ved<em&gt; In vitro</em&gt; RNA Pull-down i fedtcellerne Kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...