Name: detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)
Uploaded: 2012-05-05T14:00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH at JoVE.com

Die Autoren danken der ehemaligen und derzeitigen Mitarbeitern des Labors für Beiträge zur Entwicklung der Methodik hier skizzierten und Alan Cochrane um Rat fragen. LA ist ein Empfänger einer kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) Doctoral Fellowship und AJM wird von einem Fraser, Monat und MacPherson Career Award unterstützt. Diese Arbeit wird durch einen Zuschuss aus dem CIHR (Grant # MOP-56974) unterstützt.

1. Sondenvorbereitung <ol><li> Digest 1 ug die in vitro Transkription Vektor, ausgeführt pKS (+) Pol 236nt 9 mit Kpn1 Enzym bei 37 ° C für 1 Stunde und des linearisierten DNA-Produkt auf einem Agarosegel. Das Fragment sollte etwa 2500 bp sein. </li><li> Schneiden Sie das Fragment aus dem Gel gereinigt und unter Verwendung des Roche Micro Elute Gel Extraction Kit (alle verwendeten Reagenzien sind in Tabelle 1 aufgeführt). Führen Sie die endgültige Elution in 30 ul Elutionspuffer. Versuch 5 ul des Produkts auf einem Agarosegel, um die Reinigung zu überprüfen. </li><li> Mischen Sie ein in vitro-Transkriptions-Reaktion (siehe Rezept unten) unter Verwendung des Roche DIG RNA Labeling Kit und bei 37 ° C für 2 Stunden. </li></ol> In-vitro-Transkriptions-Reaktion: <table border="1"><tbody><tr><td> Linearisierte DNA </td><td> 23 ul </td></tr><tr><td> 1X DIG RNA Labeling Mix (Roche) </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> 1X Transcription Puffer </td><td> 8 ul </td></tr><tr><td> 20U RNase OUT </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> 80U T7-RNA-Polymerase </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 40 ul </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> In 228 U DNase I und bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Stoppen der Reaktion durch Zugabe von EDTA pH 8,0 bis zu einer Endkonzentration von 20 mM. </li><li> Reinigung der Reaktionsprodukte mit Hilfe der Quick Spin Columns von Roche als vom Hersteller angegeben. </li><li> Reinigen der Sonde durch Fällung mit 1/10 Volumen DEPC-behandeltem 3M NaOAc pH 5,2 und 2,5 Volumina eiskaltem 95% igem Ethanol. Mischen und inkubieren bei -80 ° C für 30 min bis über Nacht. </li><li> Zentrifuge die Sonde für 15 min bei 4 ° C bei 15.000 × g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und wasche das Pellet in eiskaltem 70% Ethanol. Zentrifuge erneut für 5 min bei 4 ° C bei 15.000 × g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und das Pellet trocknen. Das Pellet in 50 ul wasser (DNase / RNase frei) mit 10 U RNase OUT Invitrogen. </li><li> Schätzen Sie die Konzentration der Sonde durch Spektrophotometrie (Maßnahme RNA bei 260 nm), und mit Wasser auf eine Konzentration von 5 ng / ul. Shop in Aliquots bei -20 ° C für den kurzfristigen Einsatz, oder -80 ° C für eine langfristige Lagerung. Es wird empfohlen, inter-Assay-Vergleiche durchführen, so erhalten einen aliquoten dafür. </li></ol> 2. Zellfixierung <ol><li> Es ist zunächst wichtig, Samen anhaftenden Zellen auf unbehandelten, sterile Deckgläschen so dass die endgültige Konfluenz bei der Ernte beträgt ca. 70-80%. Für nicht-adhärenten Zellen, als normal wachsen und bei Empfang genommen werden, inkubieren mit Deckgläschen, die mit 0,01% w / v Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich, Inc.) wurden für 1 Stunde behandelt. Für einen typischen 12-Well-Polystyrol-Gewebekulturplatte (3,8 cm 2), 150.000 Zellen (zB HeLa) nach 24 Stunden vor der Transfektion ausplattiert. Nicht-adhärente Zellen kann infiziert oder transfiziert werden wie üblich und man ließ sie adSie hier, um Glasdeckgläschen vor der Fixierung 3. </li><li> Entsorgen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen mit 1X Phosphat-gepufferte Salzlösung in doppelt destilliertem Wasser (DPBS) für 1 Minute vorbereitet. Diethylpyrocarbonat (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc.) behandelt 1X PBS können ebenfalls verwendet werden, kann jedoch nicht als unbehandelte PBS darin enthaltener RNase Enzymen. </li><li> Entsorgen Sie die PBS und fügen Sie 4% Paraformaldehyd, genug, um die Zellen vollständig zu bedecken. Inkubieren Sie für 15-20 min. </li><li> Entsorgen Sie die paraformaldeyhyde und waschen Sie die Zellen mit 1X DPBS für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie die DPBS und fügen 0,1 M Glycin (gelöst in 1X DPBS). Inkubieren für 10 min. </li><li> Entsorgen Sie das Glycin und waschen Sie die Zellen mit 1X DPBS für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie die DPBS und fügen 0,2% Triton-X (gelöst in 1X DPBS). Inkubieren Sie für 5-10 min. Wenn Färbung für nukleolären oder Kernhüllenproteine, mit Triton X-100 nicht länger als 5 min oder die Protein-Lokalisierung wird diffus permeabilisieren. </li><li> Entsorgen Triton X-100 und wasche einmal in1X DPBS für 1 min. </li><li> Für die langfristige Lagerung, ersetzen PBS mit 70% Ethanol und lagern bei 4 ° C für bis zu vier Monate. Alternativ dazu noch einmal abwaschen mit 1X DPBS und fahren um zu fischen. </li></ol> 3. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) <ol><li> Wenn die Deckgläser in Ethanol gelagert wurden, ersetzen Ethanol mit 1X DPBS und die Zellen für 30 Minuten zu rehydrieren. Rehydrierung kann über Nacht geschehen, wenn die Deckgläser bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Waschen Sie die Deckgläser mit 1X DPBS für 1 min. </li><li> Bereiten Sie Folien, die auf Deckgläsern inkubieren, wobei darauf zu reinigen und zu beschriften Sie sie gut. </li><li> Für eine 18mm Deckglas, fügen Sie 50 ul DNase-Lösung (25 Einheiten / Deckglas, im Handel erhältlich) auf den Objektträger. Fügen Sie das Deckglas und achten Sie darauf, um es zu Zell-Seite Platz nach unten, und inkubieren Sie sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Deckgläser mit 1X DPBS für 1 min. </li><li> Dann werden 50 ul Hybridisierungs-Mix (siehe Rezept unten) pro Deckglas aufeine Rutsche und bebrüten das Deckglas Zelle nach unten für 16-18 h bei 42 ° C Die Inkubation sollte in einem Behälter mit 50% Formamid, 2 × SSPE Mischung (12,5 ml deionisiertes Formamid, 2,5 ml 20X SSPE, 10 ml Wasser) durchgeführt werden. </li></ol> Hybridisierung Mix (für ein Deckglas, 50 ul): <table border="1"><tbody><tr><td> Anzahl der Aktien </td><td> Material (bei ​​Endkonzentration) </td></tr><tr><td> 25 ul </td><td> Formamid, 50% (entionisiertem, jede Quelle) </td></tr><tr><td> 5 ul (von 10 mg / ml) </td><td> tRNA, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc.) </td></tr><tr><td> 5 ul (der 20X) </td><td> SSPE, 2X </td></tr><tr><td> 5 ul (50 ×) </td><td> Denharts, 5X </td></tr><tr><td> 0,125 ul (von 5 Einheiten) </td><td> RNase OUT </td></tr><tr><td> 5 ul (25 ng von 5 ng / ul) </td><td> Sonde </td></tr><tr><td> 5 ul </td><td> H 2 O DEPC, um die endgültige machenVolumen 50 pl </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> Inkubieren Deckgläser Zelle nach unten in 50 l 50% Formamid (verdünnt in 1 × DPBS) für 15 min bei 42 ° C </li><li> Waschen der Deckgläser zweimal in 2 × SSPE durch Inkubation Zelle nach unten in 50 ul 2X SSPE (20 × SSPE in 1X DPBS verdünnt) für jeweils 5 min bei 42 ° C </li><li> Waschen Sie die Deckgläser in 1X DPBS für 1 min. </li></ol> 4. Immunfluoreszenzfärbung <ol><li> Blockieren Sie die Deckgläser Zelle, indem sie sie nach unten in 50 l 1X Roche Blocking-Lösung (10X Roche Blockierungslösung in 1X DPBS verdünnt) für 30 min. </li><li> Inkubieren Sie die Deckgläser Zelle nach unten in 50 ul primären Antikörper-Lösung 1 h bei 37 ° C Anti-DIG-Antikörper sollte gemäß den Herstellerangaben Richtung in 1 × Blockierungslösung verdünnt werden. Wenn andere Antikörper verwendet wird, um Proteine ​​zu färben, kann sie an der richtigen Konzentration bereitgestellt hinzugefügt werden, dass alle verwendeten Antikörper aus verschiedenen Host-Spezifikation abgeleiteties. </li><li> Waschen Sie die Deckgläschen für 10 min in 1X DPBS. </li><li> Inkubieren Sie die Deckgläser Zelle nach unten in 50 l sekundären Antikörper-Lösung 1 h bei 37 ° C Alexa Fluor-konjugierte Antikörper (Invitrogen) verwendet werden, um einen Bereich von Farben zu erzeugen und an 1:500 in Blocking-Lösung 1X, 1X DPBS verwendet. </li><li> Waschen Sie die Deckgläser zweimal für jeweils 10 Minuten in 1X DPBS. </li><li> Trocknen Sie die Deckgläser Zelle nach oben auf Whatman-Papier. Beachten Sie unbedingt die Deckgläschen abdecken, um Belichtung und Bleichen zu vermeiden. </li><li> Sobald alle Flüssigkeit verdampft ist, montieren Sie die Deckgläser auf frische Dias mit 8 ul ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc.). Klopfen Sie sich das Deckglas, um mögliche Luftblasen zu beseitigen. </li><li> Bewerben Nagellack zu den Kanten des Deckglases, um es zu fixieren. </li><li> Die Visualisierung von RNA und Proteinen durch Mikroskopie-Techniken ist auch entscheidend für den Erfolg dieser Technik. Einstellungen am Mikroskop eingesetzt werden können fördern oder behindern Visualisierung so ist, dass der SchlüsselEinstellungen am Mikroskop richtig eingestellt sein und konsequent sein von einer Probe zur anderen in einem gegebenen Experiment. Für detaillierte Mikroskopie Einstellungen finden Optik-und Antikörper-Kombinationen siehe Referenzen 1,10. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel der Virus-RNA-Färbung kann in 2 gesehen werden. Die virale RNA von HIV-1 wird im Cytoplasma diffus zum größten Teil angezeigt gesehen, obwohl kleines Cytoplasma Tränenpünktchen nicht ungewöhnlich sind. Die Spezifität kann durch den Vergleich positiver Zellen in die umliegenden Zellen, die keine Fluoreszenz Display abgelesen werden. Wie in der Einleitung erwähnt, erzeugt HIV-1, die die regulatorischen Rev-Protein fehlt RNA, die im Kern gehalten wird: das man sich als helles Signal im Kern kann, und einen Mangel an RNA Fluoreszenzsignal im Zytoplasma. Die Überexpression von zellulären Proteinen ist auch, das fähig ist die Verteilung der HIV-1 Virus-RNA. In Abbildung 2 </strong&gt;, die Überexpression von Proteinen in endosomalen Vesikel Menschenhandel verwickelt sind (z. B. Rab7-Interaktion lysosomalen Proteins (RILP) 11 oder N-terminal deletierten RILP (RILPN) 11, und Proteine, die mit Dynein motorischen Funktion beeinträchtigen [zB p50/dynamitin 1, 12], mit dem normalen steady-state Lokalisation der viralen genomischen RNA, wie durch FISH-Analysen bestimmt stören RILP Ausdruck führt wieder Lokalisation der viralen genomischen RNA an die Mikrotubuli-Organisation Zentrum (MTOC) 13;. RILPN verteilt späten Endosomen innerhalb der Zytoplasma aufgrund der Unfähigkeit, sich an p150 der Dynein motorischer Komplex p50/dynamitin Blöcken 14 und die große Untereinheit der Dynein Motor und Meldungen geklebtem binden späten Endosomen, sondern auch die virale genomische RNA und HIV-1 Proteinen zu der Zellperipherie 1 (Abbildung 2). Die Manipulation der Steady-State-Lokalisation der viralen genomischen RNA, einen wichtigen Beitrag zu der InfektiositätViruspartikel, wäre der Schlüssel zur späteren Entwicklung von Therapeutika. In unseren Händen, erscheint viraler RNA in der Zelle schon nach 3 Stunden nach der Transfektion und Infektion 10 und wird leicht beobachtbaren dieses FISH-Technik von 12 Stunden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ablaufplan des Protokolls über Fisch / IF Co-Analysen. Die Zellen werden auf Deckgläsern gezüchtet und dann mit Paraformaldehyd fixiert. Behandlungen von Glycin und Triton-X durchgeführt werden, bevor die Zellen entweder für FISH / IF verwendet oder gelagert in 70% Ethanol für die Lagerung. Die Zellen dehydriert für die Lagerung sind in 1X DPBS (DEPC-behandeltem PBS) bevor es weiter nach FISH / IF rehydriert. Die Zellen werden mit DNase I behandelt und über Nacht stehen gelassen, um mit der Sonde hybridisieren. Sobald Hybridisierung abgeschlossen ist, werden die Zellen gewaschen, mit Formamid, sowie mit SSPE, und eine letzte 1X DPBS spülen. Blockierungslösung wird auf die Zellen aufgebracht, gefolgt von Inkubation mitdie primären Antikörper. Nach dem Waschen werden Sekundärantikörper aufgetragen. Zwei abschließende Waschungen in 1X DPBS runden das Färbeverfahren, wo auf die Deckgläser getrocknet und auf Objektträger für die Bildgebung. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung von FISH / IF Co-Analysen. A) HIV-1 wird in HeLa-Zellen und in einigen Fällen mit Konstrukten, die die Überexpression von zellulären Proteinen (RILP, p50/Dynamitin und RILPΔN (eine Amino-Deletionsmutante) zu transfiziert) . FISCH / IF Co-Analysen durchgeführt: RNA ist in grün entweder mit oder G3BP LAMP1 (rot) identifiziert zu unterscheiden. B) HIV-1 wird in HeLa exprimiert und gesammelt zu verschiedenen Zeitpunkten. Viral RNA-Expression wird in grün verfolgt, während die zellulären Proteins, hnRNP A1, in rot gefärbt wird. Größe Bars sind 10 um. Bilder von Referenzen 1 (select Zahlen aus Feld A; RILP, p50/Dynamitin und RILP DeltaN) geändertund 17 (Feld B).

<ol>
	<li>Lehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+transport+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomic+RNA+and+viral+production+are+dependent+on+dynein+motor+function+and+late+endosome+positioning.">Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning.</a> J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).</li><li>Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+mRNA+interactions+with+RNA+granules+during+translation+initiation+inhibition.">Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition.</a> PLoS One. 6, e19727 (2011).</li><li>Abrahamyan, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Staufen1+ribonucleoproteins+prevent+formation+of+stress+granules+but+favour+encapsidation+of+HIV-1+genomic+RNA.">Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA.</a> J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).</li><li>Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+visualization+of+the+interactions+between+HIV-1+Gag+and+the+cellular+RNA-binding+protein+Staufen1.">Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1.</a> Retrovirology. 7, 41-41 (2010).</li><li>Vercruysse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cooperative+Rev+protein-protein+interactions+on+Rev+responsive+RNA+by+fluorescence+resonance+energy+transfer.">Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer.</a> RNA Biol. 8, 316-324 (2011).</li><li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+mRNA+export:+insights+from+virology.">Nuclear mRNA export: insights from virology.</a> Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).</li><li>Cmarko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rev+inhibition+strongly+affects+intracellular+distribution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNAs.">Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs.</a> J Virol. 76, 10473-10484 (2002).</li><li>Ajamian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+roles+for+UPF1+in+HIV-1+RNA+metabolism+and+translation.">Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation.</a> RNA. 14, 914-927 (2008).</li><li>Beriault, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+late+role+for+the+association+of+hnRNP+A2+with+the+HIV-1+hnRNP+A2+response+elements+in+genomic+RNA,+Gag,+and+Vpr+localization.">A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization.</a> J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).</li><li>Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+remodels+the+nuclear+pore+complex.">HIV-1 remodels the nuclear pore complex.</a> J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).</li><li>Jordens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rab7+effector+protein+RILP+controls+lysosomal+transport+by+inducing+the+recruitment+of+dynein-dynactin+motors.">The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors.</a> Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).</li><li>Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+imaging+reveals+a+peroxisomal+reticulum+in+living+cells.">Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).</li><li>Levesque, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+HIV-1+RNA+is+mediated+by+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A2+expression+and+impacts+on+viral+assembly.">Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly.</a> Traffic. 7, 1177-1193 (2006).</li><li>Rocha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+sensor+ORP1L+contacts+the+ER+protein+VAP+to+control+Rab7-RILP-p150+Glued+and+late+endosome+positioning.">Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning.</a> J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).</li><li>Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Rev+function+by+a+dominant-negative+mutant+of+Sam68+through+sequestration+of+unspliced+RNA+at+perinuclear+bundles.">Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles.</a> J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).</li><li>Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hRIP,+a+cellular+cofactor+for+Rev+function,+promotes+release+of+HIV+RNAs+from+the+perinuclear+region.">hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region.</a> Genes Dev. 18, 23-34 (2004).</li><li>Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+induces+the+cytoplasmic+retention+of+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A1+by+disrupting+nuclear+import:+implications+for+HIV-1+gene+expression.">Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression.</a> J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).</li><li>Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+rev+trans-activator+acts+through+a+structured+target+sequence+to+activate+nuclear+export+of+unspliced+viral+mRNA.">The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA.</a> Nature. 338, 254-257 (1989).</li><li>Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+destinies:+degradation,+targeting,+assembly,+and+endocytosis+of+HIV+Gag.">Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag.</a> AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).</li><li>Molle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+trafficking+of+HIV-1+gag+and+genomic+RNAs+regulates+viral+egress.">Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress.</a> J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+coimaging+of+the+genomic+RNAs+and+Gag+proteins+of+two+lentiviruses.">Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses.</a> J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li><li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions.">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

FISCH / IF Co-Analysen ist eine zuverlässige Methode zur Erkennung viraler RNA in Zellen, die inzwischen verfeinert 9,15,16 visualisieren. Im Laufe von mehreren Jahren haben wir eine raffinierte Methode der Färbung für RNA entwickelt. Diese Technik kann auf einer Vielzahl von Zelltypen sofern die Sonde spezifisch an die Ziel-RNA 17 verwendet werden. Durch die Markierung der Sonde mit DIG, sind wir imstande, die Visualisierung der RNA durch eine einfache Färbung. Wenn für die RNA-Färbung und anderen Proteinen kombiniert werden, FISH / IF Co-Analysen zu einem mächtigen Werkzeug, um zelluläre Strukturen und Protein / RNA-Lokalisierung zu beobachten. Die Spezifität der RNA-Detektion ist ziemlich hoch. Dies ist in 2 dargestellt. In einigen der ursprünglichen Arbeiten, die auf viralen genomischen RNA-Lokalisierung, FISH festgestellt, dass ein Mangel an Rev virale RNA im Zellkern 18 gefangen konzentriert. Da dies hat reichlich neue Informationen über die viralen genomischen RNA Lokalisation wurde unter Verwendung des technique hier skizzierte. Durch Überexpression von zellulären Proteinen, können bestimmte Populationen und nicht alle-der viralen RNA gezwungen, zu den verschiedenen Regionen der Zelle lokalisiert werden. RILP Überexpression, welche den Phänotyp erinnert erhalten wird, wenn hnRNP A2 wird durch siRNA in erschöpften HIV-1-exprimierenden Zellen 13, bewirkt, dass die RNA sichtbar zu der MTOC ansammeln. P50/Dynamitin Überexpression oder Knockdown der Dynein schwere Kette 1 führt zur Freisetzung von viralen genomischen RNA aus intrazellulären Domänen der zellulären Peripherie (: Die viralen genomischen RNA kann an der Zellperipherie, indem Sie die Minus-Ende Motorprotein, Dynein geschoben werden Abbildung 2). Eine Mutante von RILP, RILPΔN, die nicht mehr bindet das Dynein-Motor, zerstreut Endosomen (markiert durch LAMP1) in das Zytoplasma, weil sie nicht mehr aktiv an juxtanuclear Domänen lokalisiert sind. Diese Ergebnisse weisen auf die Vorstellung von einem Kunststoff-Population von HIV-1-Genom-RNA und insbesondere, dass verschiedene Pools von HIV-1-Genom-RNA mit teilweise identifizierbaren Rollen in der viralen Replikationszyklus abgegeben. Diese dieselben Begriffe bereits für das Protein von dieser mRNA kodiert Gag 19 identifiziert. Es gibt Einschränkungen für die Verwendungen der FISH / IF Co-Analysen, die auf Antikörper nach Wahl und Verfügbarkeit verbunden sind. Die Optimierung der besten Kombination aus primären und sekundären Antikörper und deren Konzentrationen, wird einige Zeit dauern, um zu optimieren (siehe Tabelle 1 und 2). Antikörper aus Hybridomen gemacht oder von großen Unternehmen hergestellt werden müssen, die überall Konzentrationen variieren von 1:2 bis 1:2000, aber sicher sein, um die Leitlinien der vom Hersteller für beste Ergebnisse befolgen. Die Wirt, in dem der Antikörper produziert muss auch unter Betracht gezogen werden. Mixing Schafe mit Ziegen-Antikörper sollte auch im primären und sekundären Antikörpern, da diese Kombination führt zu hohen Hintergrund durch cross-species Anerkennung (Daten nicht gezeigt) vermieden werden. Für Alexa-Fluor secondary Antikörper, kann die Konzentration an 1:500 für fast jede Antikörper in der Menge verwendet werden. Der andere Nachteil bei FISH / IF Co-Analysen in diesem Bericht beschrieben wird, ist es erfasst die RNA an seinem Standort im Steady-State, nachdem Zellen behoben wurden und permeabilisierten mit Paraformaldehyd und Reinigungsmittel (Abbildung 1). Jedoch hat sich die RNA Bildgebung in lebenden Zellen durch eine Vielzahl von Mitteln erreicht 20-22, meist unter Verwendung von Variationen der viralen RNA-Genome, die durch fluoreszierende Proteine, wie zB GFP versehen sind. Jedoch weiterhin zusätzliche Mittel an die RNA-Lokalisierung in lebenden Zellen zu identifizieren an die Oberfläche. Diese neuen Verfahren beinhalten die Tagging-RNA mittels Spinat 23, SNAP 24 oder MTrip 2. Diese Techniken leiden unter einigen Nachteilen einschließlich der Anforderung, Zellen vor Zugabe von Substraten oder dass eine Einheit konstruiert ist, um die mRNA zu markieren, zu detektieren die mRNA durch Mikroskopie bestimmt werden permeabilisieren. Tatsächlich ist die große ADVAntage von FISH-Analysen in diesem Bericht beschriebenen liegt in der Tatsache, dass die native RNA unverändert ist, die zu den meisten physiologisch relevante Ergebnisse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 18mm Deckgläsern </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyd </td><td> JT Baker </td><td> S898-07 </td><td> Bis 4% machen: Lösen Sie 20 g in 500 mL 1XDPBS bei 60 ° C mit 5 Tropfen Natronlauge. pH-Wert auf 7,2 vor der Hitze und Lagerung bei -20 ° C. Nicht mehr als 70 ° C! </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Elute Gel Extraction Kit </td><td> Roche </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA Labelling Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> Transkription T7-RNA-Polymerase </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Quick Spin Columns </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNase OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescent Antibody Enhancer Set für DIG-Erkennung # 4 (Blockierungslösung) </td><td> Roche </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor Sekundärantikörper </td><td> Invitrogen </td><td> Siehe Tabelle 2 </td><td></td></tr><tr><td> Hybridisierungsofen </td><td> Sci Boekelschaftliche </td><td> Modell 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroobjekttragerglaschen </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Identifizierung von spezifischen Reagenzien und Ausrüstung <table border="1"><tbody><tr><td> Arten von Anti-DIG-Antikörper (Verdünnung; Unternehmen, Katalog-Nummer) </td><td> Farben </td><td> Alexa Fluor gebrauchten (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Maus (1:500; Sigma, B7405) </td><td> grün </td><td> Alexa Fluor 488 Esel-anti-Maus (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> rot </td><td> Alexa Fluor 594 Esel-anti-Maus (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> blau </td><td> Alexa Fluor 647 Esel-anti-Maus (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sheep (1:200; Roche, 11376623) </td><td> grün </td><td> Alexa Fluor 488 Esel-anti-Schaf (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> rot </td><td> Alexa Fluor 594 Esel-anti-Schaf (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> blau </td><td> Alexa Fluor 647 Esel-anti-Schaf (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Kombinationen von sekundären Antikörpern und Anti-DIG mit Katalognummern und aufgeführten Konzentrationen.

detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)

Viren infizieren die Zellen auszulösen spezifische Änderungen an normalen Zellfunktionen, die Energie und Ressourcen für die virale Replikation ablenken zu dienen. Viele Aspekte der Wirtszelle Funktion von Viren requiriert, üblicherweise durch die Expression von viralen Genprodukten, rekrutieren Wirtszellproteinen und Maschinen. Darüber hinaus, Viren Ingenieur-spezifischen Membran-Organellen oder Schild auf die mobile Vesikel und Motorproteine ​​Regionen der Zelle (während der de novo-Infektion, Viren kooptieren molekularen Motor Proteine ​​in den Kern Ziel gewirkt, später während der Virus Anordnung, werden sie kapern zellulären Maschinen, die in der Montage von Viren helfen wird). Weniger ist, wie Viren, insbesondere solche mit RNA-Genome, koordinieren den intrazellulären Transport von sowohl Protein und RNA-Komponenten und deren Anordnung zu erreichen infektiöser Partikel an bestimmten Orten in der Zelle zu verstehen. Die Untersuchung der RNA Lokalisation begann in früheren Arbeiten. Entwicklung von niederen eukaryotischen emEmbryonen und neuronale Zellen lieferten wichtige biologische Informationen, und auch die Bedeutung von RNA-Lokalisation in der Programmierung der Genexpression Kaskaden. Die Studie in anderen Organismen und Zellsysteme hat ähnlich wichtige Informationen lieferte. Viren sind obligate Parasiten und müssen ihre Wirtszellen zu nutzen, um zu replizieren. Somit ist es wichtig zu verstehen, wie RNA-Viren die RNA-Genome aus dem Kern zu leiten, durch die nukleäre Pore, durch das Cytoplasma und einem seiner endgültigen Bestimmungsort in reifen Viruspartikel 1. FISH dient als nützliches Instrument, um Veränderungen in der Steady-State-Lokalisierung von viraler RNA zu identifizieren. Wenn sie mit Immunfluoreszenz (IF) Analyse 22, FISH / IF Co-Analysen werden Informationen über die Co-Lokalisation von Proteinen liefern mit der viralen RNA-3 kombiniert. Diese Analyse ist somit ein guter Ausgangspunkt, um für die RNA-Protein-Wechselwirkungen mit anderen biochemischen oder biophysikalischen testenTests 4,5, da die Co-Lokalisierung allein ist nicht genug Beweise sicher zu sein, von einer Wechselwirkung. Bei der Untersuchung viraler RNA-Lokalisierung mit einem Verfahren wie diesem, hat eine Fülle von Informationen auf beiden viralen und zellulären RNA Menschenhandel Veranstaltungen 6 gewonnen. Zum Beispiel produziert HIV-1 RNA in den Zellkern der infizierten Zellen, aber die RNA nur in dem Cytoplasma übersetzt. Wenn eine Taste virales Protein fehlt (Rev) 7 hat FISH der viralen RNA zeigte, dass der Block die virale Replikation durch die Beibehaltung der genomischen HIV-1 RNA im Kern 8 ist. Hier stellen wir die Methode für die visuelle Analyse der viralen genomischen RNA in situ. Das Verfahren ermöglicht die Verwendung eines markierten RNA-Sonde. Diese Sonde ist so konzipiert, dass komplementär zu den viralen genomischen RNA. Während der in vitro-Synthese von Antisense-RNA-Sonde, die das Ribonukleotid mit Digoxigenin (DIG) modifiziert wird in einem in vitro transcr enthalteniption Reaktion. Sobald die Sonde an die Ziel-mRNA in Zellen hybridisiert hat, werden nachfolgende Schritte Antikörpermarkierung (1) zeigen die Lokalisation der mRNA als auch Proteine ​​von Interesse bei der Durchführung FISH / IF.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH at JoVE.com

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Ein Fluoreszenz-<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)-Methode wurde entwickelt, um visuell Nachweis der viralen genomischen RNA mittels Fluoreszenzmikroskopie. Eine Sonde mit Spezifität zu der viralen RNA, die dann identifiziert unter Verwendung einer Kombination der Hybridisierung und Immunfluoreszenz-Techniken gemacht werden können. Diese Technik bietet den Vorteil der Identifizierung der Lokalisation der viralen RNA oder DNA im Steady-State, Bereitstellung von Informationen über die Kontrolle der intrazellulären Virus Menschenhandel Veranstaltungen.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Forschung

Biologie

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) zu X-Chromosom-Inaktivierung in Differenzierte Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus Studieren

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Schnell Fluorescent<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll für Xist-RNA in Kombination mit Immunfluoreszenz von Histonmodifikationen in X-Chromosom-Inaktivierung

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em&gt; In-situ-</em&gt; Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...