Name: detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)
Uploaded: 2012-05-05T14:00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH at JoVE.com

Forfatterne takker tidligere og nåværende medlemmer av lab for bidrag til utviklingen av metodikken skissert her og til Alan Cochrane om råd. LA er en mottaker av en kanadisk Institutes of Health Research (CIHR) doc og AJM støttes av en Fraser, Monat og MacPherson Career Award. Dette arbeidet støttes av en bevilgning fra CIHR (tilskuddet # MOP-56974).

1. Probe Forberedelse <ol><li> Digest 1 mikrogram av in vitro transkripsjon vektor, PKS (+) pol 236nt 9 med Kpn1 enzym ved 37 ° C i 1 time og kjøre lineær DNA produktet på en agarose gel. Fragmentet skal være ca 2500 bp. </li><li> Skjær fragment ut av gel og rense med Roche Micro Eluer Gel Extraction Kit (alle reagenser brukt, er oppført i tabell 1). Utfør endelige eluering i 30 mL eluering buffer. Kjør 5 mL av produktet på en agarose gel for å verifisere rensing. </li><li> Bland en in vitro transkripsjon reaksjoner (se oppskrift nedenfor) bruker Roche DIG RNA merking kit og Inkuber ved 37 ° C i 2 timer. </li></ol> In vitro transkripsjon reaksjon: <table border="1"><tbody><tr><td> Lineært DNA </td><td> 23 mL </td></tr><tr><td> 1X DIG RNA merking mix (Roche) </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> 1X Transcription buffer </td><td> 8 mL </td></tr><tr><td> 20U RNase OUT </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> 80U T7 RNA polymerase </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Total </td><td> 40 mL </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Legg 228 U av DNase I og Inkuber ved 37 ° C i 15 min. </li><li> Stopp reaksjonen ved å tilsette EDTA pH 8,0 til en endelig konsentrasjon på 20 mM. </li><li> Rense reaksjonen ved hjelp av Quick Spin Kolonner fra Roche, som spesifisert av produsenten. </li><li> Renser sonden av nedbør med 1/10 volum DEPC behandlet 3M NaOAc pH 5,2 og 2,5 mengder iskald 95% etanol. Bland og inkuber ved -80 ° C i 30 min til over natten. </li><li> Sentrifuger sonden i 15 min ved 4 ° C ved 15 000 x g.. </li><li> Fjern supernatanten og vask pellet i iskaldt 70% etanol. Sentrifuger igjen for 5 min ved 4 ° C ved 15 000 x g.. </li><li> Fjern supernatanten og tørk pellet. Resuspender det pellet i 50 mL water (DNase / RNase fri) inneholder 10 U Invitrogen RNase OUT. </li><li> Beregn konsentrasjonen av sonden ved spektrofotometri (måle RNA ved 260 nm), og fortynn til en konsentrasjon på 5 ng / mL. Lagres i alikvoter ved -20 ° C for kort tids bruk, eller -80 ° C for langtidslagring. Det anbefales å utføre blant analyseverdier sammenligninger så spare en delmengde for dette. </li></ol> 2. Cell Fixation <ol><li> Det er i utgangspunktet viktig å frø heftende celler inn på ubehandlet, sterile glass Dekkglass så det endelige confluency ved høsting er ca 70-80%. For ikke-heftende celler, vokser som normalt og når du er klar til å samle, inkuber dem med Dekkglass som har blitt behandlet med 0,01% w / v poly-L-lysin (Sigma-Aldrich, Inc.) i 1 time. For en typisk 12-brønnen polystyren vevskultur plate (3,8 cm 2), er 150.000 celler (f.eks Jakten) belagt med 24 timer før transfeksjon. Ikke-heftende celler kan bli smittet eller tilført som vanlig og lov til annonsenher glassdeksel slips før fiksering tre. </li><li> Kast media og vaske cellene med 1X fosfat-bufret saltvann utarbeidet i dobbelt destillert vann (DPBS) i 1 min. Diethylpyrocarbonate (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc.)-behandlet 1X PBS kan også brukes, kan imidlertid ubehandlet PBS ikke da det kan inneholde RNase enzymer. </li><li> Kast PBS og legg 4% paraformaldehyde, nok til å dekke cellene helt. Inkuber i 15-20 min. </li><li> Kast paraformaldeyhyde og vask celler med 1x DPBS for 1 min. </li><li> Kast DPBS og legg 0,1 M glysin (oppløst i 1X DPBS). Inkuber i 10 min. </li><li> Kast glysin og vaske cellene med 1x DPBS for 1 min. </li><li> Kast DPBS og legg 0,2% Triton-X (oppløst i 1X DPBS). Inkuber i 5-10 min. Dersom beising for nucleolar eller kjernefysisk konvolutt proteiner, permeabilize med Triton X-100 for ikke mer enn 5 min eller protein lokalisering blir diffus. </li><li> Kast Triton X-100 og vaske en gang i1X DPBS i 1 min. </li><li> For langtidslagring, erstatte PBS med 70% etanol og oppbevares ved 4 ° C i opptil fire måneder. Alternativt vaske igjen med 1x DPBS og fortsette å fiske. </li></ol> 3. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) <ol><li> Hvis Dekkglass ble oppbevart i etanol, erstatte etanol med 1x DPBS og la cellene til å rehydrere i 30 min. Rehydrering kan gjøres over natten hvis Dekkglass lagres ved 4 ° C. </li><li> Vask Dekkglass med 1x DPBS for 1 min. </li><li> Forbered lysbilder til Inkuber Dekkglass på, ta vare å rengjøre og merke dem godt. </li><li> For en 18mm dekkglass, tilsett 50 mL av DNase løsning (25 enheter / dekkglass og kommersielt tilgjengelige) til lysbildet. Tilsett dekkglass, være sikker på å plassere den celle side ned, og inkuber den for 15 minutter ved romtemperatur. </li><li> Vask Dekkglass med 1x DPBS for 1 min. </li><li> Tilsett 50 mL hybridisering blanding (se oppskrift nedenfor) per dekkglass pået lysbilde og Inkuber dekkglass cellen ned for 16-18 t ved 42 ° C. Inkubasjon bør utføres i en skuff som inneholder en 50% formamide, 2X SSPE mix (12,5 ml avionisert formamide, 2,5 ml 20X SSPE, 10 ml vann). </li></ol> Hybridisering Mix (for en dekkglass, 50 mL): <table border="1"><tbody><tr><td> Mengde på lager </td><td> Material (at endelig konsentrasjon) </td></tr><tr><td> 25 mL </td><td> Formamide, 50% (avionisert, alle kilder) </td></tr><tr><td> 5 mL (av 10 mg / ml) </td><td> tRNA, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc) </td></tr><tr><td> 5 mL (av 20X) </td><td> SSPE, 2X </td></tr><tr><td> 5 mL (av 50X) </td><td> Denharts, 5X </td></tr><tr><td> 0,125 mL (av 5 enheter) </td><td> RNase OUT </td></tr><tr><td> 5 mL (25 ng av 5 ng / mL) </td><td> Probe </td></tr><tr><td> 5 mL </td><td> H 2 O DEPC, for å gjøre den endeligevolum 50 mL </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> Inkuber Dekkglass celle side ned i 50 mL 50% formamide (utvannet i 1X DPBS) for 15 minutter ved 42 ° C. </li><li> Vask Dekkglass to ganger i 2X SSPE ved å inkubere dem celle side ned i 50 mL 2X SSPE (20X SSPE fortynnet i 1X DPBS) i 5 min hver på 42 ° C. </li><li> Vask Dekkglass i 1X DPBS for 1 min. </li></ol> 4. Immunfluorescens Farging <ol><li> Blokkere Dekkglass ved å plassere dem celle side ned i 50 mL 1X Roche blokkering løsning (10X Roche blokkere løsning fortynnes i 1X DPBS) i 30 min. </li><li> Inkuber Dekkglass cellen ned i 50 mL primær antistoff løsning i 1 time ved 37 ° C. Anti-DIG antistoff bør fortynnes i henhold til produsentens retning i 1X blokkering løsning. Hvis andre antistoffer blir brukt for å farge proteiner, kan de legges i riktig konsentrasjon forutsatt at alle antistoffer som brukes er hentet fra ulike host spectallet. </li><li> Vask Dekkglass for 10 min i 1X DPBS. </li><li> Inkuber Dekkglass cellen ned i 50 mL sekundært antistoff løsning i 1 time ved 37 ° C. Alexa Fluor-konjugerte antistoffer (Invitrogen) kan brukes til å generere en rekke farger og brukes til 1:500 i 1X blokkerer løsning, 1X DPBS. </li><li> Vask Dekkglass to ganger i 10 min hver i 1X DPBS. </li><li> Tørk Dekkglass celle siden opp på Whatman papir. Pass på å dekke Dekkglass å unngå eksponering for lys og bleking. </li><li> Når all væsken er fordampet, montere Dekkglass på ferske lysbilder med 8 mL ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc.). Bank forsiktig på ned dekkglass å eliminere eventuelle luftbobler. </li><li> Påfør neglelakk til kantene av dekkglass for å sikre det på plass. </li><li> Visualisering av RNA og proteiner ved mikroskopi teknikker er også avgjørende for å lykkes med denne teknikken. Innstillinger på mikroskop kan hjelpe eller hindre visualisering så det er viktig atinnstillinger på mikroskopet være riktig innstilt og være konsekvent fra en prøve til en annen i en gitt eksperiment. For detaljerte mikroskopi innstillinger, optikk og antistoff kombinasjoner se referanser 1,10. </li></ol> 5. Representative Resultater Et eksempel på viral RNA flekker kan sees i figur 2. De virale RNA for HIV-1 er sett gjennom hele cytoplasma vises diffust for det meste, men lite cytoplasmisk punctae er ikke uvanlig. Spesifisiteten kan sees ved å sammenligne positive celler til omkringliggende celler som viser ingen fluorescens. Som nevnt i innledningen, produserer HIV-1 som mangler den regulatoriske Rev protein RNA som er beholdt i kjernen: Dette kan visualiseres som en lysende signal i kjernen, og en mangel på RNA fluorescens signal i cytoplasma. Overuttrykte cellulære proteiner er også i stand til å forskyve fordelingen av HIV-1 viral RNA. I figur 2 </strong&gt;, den overuttrykte proteiner involvert i endosomal vesikkel menneskehandel (f.eks Rab7-samhandler lysosomal protein (RILP) 11 eller N-terminalt slettet RILP (RILPN) 11, og proteiner som forstyrrer dynein motorikk [f.eks p50/dynamitin 1, 12], forstyrre den normale steady-state lokalisering av viral genomisk RNA som bestemmes av FISH analyser RILP uttrykk fører til re-lokalisering av viral genomisk RNA til microtubuli organisasjonen sentrum (MTOC) 13;. RILPN sprer sent endosomes innenfor Cytoplasma grunn av manglende evne til å binde seg til P150 Limte av dynein motor komplekset 14 og p50/dynamitin blokkerer store subenheten av dynein motor og utgivelser endosomes sent, men også den virale genomisk RNA og HIV-1 strukturelle proteiner i cellen periferien 1 (Figur 2). manipulering av steady-state lokalisering av viral genomisk RNA, en sentral bidragsyter til smittsomhet avviruspartikler, ville være nøkkelen til eventuell utvikling av legemiddelselskap. I våre hender, synes viral RNA i cellen så tidlig som 3 timer etter transfeksjon og infeksjon 10 og blir lett observerbart av denne fisken teknikken med 12 timer. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> Figur 1. Flytskjema over protokollen for FISH / IF co-analyser. Cells er dyrket på Dekkglass og deretter festes med paraformaldehyde. Behandlinger av glysin og Triton-X utføres før cellene blir enten brukt til FISH / IF eller lagres i 70% etanol for oppbevaring. Celler dehydrerte for lagring er utvannet i 1X DPBS (DEPC behandlet PBS) før du fortsetter videre til FISH / IF. Cellene behandles med DNase I og forlot natten til hybridize med sonde. Når hybridisering er fullført, blir cellene vasket med formamide, samt med SSPE, og en endelig 1X DPBS skyll. Blokkering løsning brukes til cellene, etterfulgt av inkubasjon medde primære antistoffer. Etter vask er sekundære antistoffer anvendes. To endelige vask i 1X DPBS fullføre flekker prosedyre der på de Dekkglass blir tørket og montert på lysbilder for imaging. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> Figur 2. Representative resultater ved hjelp av FISH / IF co-analyser. A) HIV-1 er tilført i Jakten celler og i noen tilfeller med konstruksjoner som forårsaker overekspresjon av cellulære proteiner (RILP, p50/Dynamitin og RILPΔN (en amino-terminal sletting mutant)) . FISH / IF co-analyser ble utført: RNA er identifisert i grønt med enten G3BP eller LAMP1 (rød) for å skille. B) HIV-1 er uttrykt i Jakten og samles på forskjellige tidspunkt. Viral RNA uttrykk spores i grønt mens den cellulære protein, hnRNP A1, er farget i rødt. Størrelse linjene er 10 mikrometer. Bilder modifiserte fra referanser 1 (utvalgte tall fra panel A; RILP, p50/Dynamitin, og RILP deltaN)og 17 (panel B).

<ol>
	<li>Lehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+transport+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomic+RNA+and+viral+production+are+dependent+on+dynein+motor+function+and+late+endosome+positioning.">Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning.</a> J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).</li><li>Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+mRNA+interactions+with+RNA+granules+during+translation+initiation+inhibition.">Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition.</a> PLoS One. 6, e19727 (2011).</li><li>Abrahamyan, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Staufen1+ribonucleoproteins+prevent+formation+of+stress+granules+but+favour+encapsidation+of+HIV-1+genomic+RNA.">Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA.</a> J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).</li><li>Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+visualization+of+the+interactions+between+HIV-1+Gag+and+the+cellular+RNA-binding+protein+Staufen1.">Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1.</a> Retrovirology. 7, 41-41 (2010).</li><li>Vercruysse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cooperative+Rev+protein-protein+interactions+on+Rev+responsive+RNA+by+fluorescence+resonance+energy+transfer.">Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer.</a> RNA Biol. 8, 316-324 (2011).</li><li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+mRNA+export:+insights+from+virology.">Nuclear mRNA export: insights from virology.</a> Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).</li><li>Cmarko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rev+inhibition+strongly+affects+intracellular+distribution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNAs.">Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs.</a> J Virol. 76, 10473-10484 (2002).</li><li>Ajamian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+roles+for+UPF1+in+HIV-1+RNA+metabolism+and+translation.">Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation.</a> RNA. 14, 914-927 (2008).</li><li>Beriault, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+late+role+for+the+association+of+hnRNP+A2+with+the+HIV-1+hnRNP+A2+response+elements+in+genomic+RNA,+Gag,+and+Vpr+localization.">A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization.</a> J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).</li><li>Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+remodels+the+nuclear+pore+complex.">HIV-1 remodels the nuclear pore complex.</a> J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).</li><li>Jordens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rab7+effector+protein+RILP+controls+lysosomal+transport+by+inducing+the+recruitment+of+dynein-dynactin+motors.">The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors.</a> Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).</li><li>Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+imaging+reveals+a+peroxisomal+reticulum+in+living+cells.">Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).</li><li>Levesque, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+HIV-1+RNA+is+mediated+by+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A2+expression+and+impacts+on+viral+assembly.">Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly.</a> Traffic. 7, 1177-1193 (2006).</li><li>Rocha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+sensor+ORP1L+contacts+the+ER+protein+VAP+to+control+Rab7-RILP-p150+Glued+and+late+endosome+positioning.">Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning.</a> J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).</li><li>Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Rev+function+by+a+dominant-negative+mutant+of+Sam68+through+sequestration+of+unspliced+RNA+at+perinuclear+bundles.">Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles.</a> J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).</li><li>Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hRIP,+a+cellular+cofactor+for+Rev+function,+promotes+release+of+HIV+RNAs+from+the+perinuclear+region.">hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region.</a> Genes Dev. 18, 23-34 (2004).</li><li>Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+induces+the+cytoplasmic+retention+of+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A1+by+disrupting+nuclear+import:+implications+for+HIV-1+gene+expression.">Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression.</a> J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).</li><li>Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+rev+trans-activator+acts+through+a+structured+target+sequence+to+activate+nuclear+export+of+unspliced+viral+mRNA.">The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA.</a> Nature. 338, 254-257 (1989).</li><li>Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+destinies:+degradation,+targeting,+assembly,+and+endocytosis+of+HIV+Gag.">Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag.</a> AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).</li><li>Molle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+trafficking+of+HIV-1+gag+and+genomic+RNAs+regulates+viral+egress.">Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress.</a> J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+coimaging+of+the+genomic+RNAs+and+Gag+proteins+of+two+lentiviruses.">Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses.</a> J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li><li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions.">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007 (2011).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

FISH / IF co-analyser er en pålitelig metode for å visualisere viral RNA i cellene som nå har blitt raffinert 9,15,16. I løpet av flere år har vi utviklet en raffinert metode for farging for RNA. Denne teknikken kan brukes på et bredt spekter av celletyper forutsatt at sonden er spesifikk for målet RNA 17. Ved merking sonden med DIG, er vi i stand til å visualisere RNA av enkle farging. Når farging for RNA og andre proteiner er kombinert, FISH / IF co-analyser bli et kraftig verktøy for å observere cellulære strukturer og protein / RNA lokalisering. Spesifisiteten av RNA påvisning er ganske høy. Dette er illustrert i figur 2. I noen av de opprinnelige arbeid som fokuserte på viral genomisk RNA lokalisering, FISH fast at mangel på Rev fanget virale RNA i cellekjernen 18. Siden dette har rikelig ny informasjon om viral genomisk RNA lokalisering er innhentet ved hjelp av technique skissert her. Ved overekspresjon cellulære proteiner, kan spesifikke populasjoner-og ikke alle av de virale RNA bli tvunget til å lokalisere til ulike regioner i cellen. RILP overexpression, som ligner på fenotypen oppnås når hnRNP A2 er oppbrukt etter siRNA i HIV-1-uttrykke celler 13, fører til at RNA til synlig samle på MTOC. De viral genomisk RNA kan skyves til cellen periferien ved å deaktivere minus-end motor protein, dynein: p50/Dynamitin overuttrykte eller knockdown av dynein tunge kjeden 1 resulterer i utslipp av viral genomisk RNA fra intracellulære domener til mobilnettet periferien ( Figur 2). En mutant av RILP, RILPΔN, som ikke lenger binder dynein motor, endosomes sprer (merket med LAMP1) til cytoplasma fordi de ikke lenger aktivt lokalisert på juxtanuclear domener. Disse resultatene peker til forestillingen om en plast befolkning av HIV-1 genomisk RNA og spesielt, at ulike bassenger av HIV-1 genomiskRNA finnes med noen identifiserbare roller i virusreplikasjon syklus. De samme begrepene har allerede blitt identifisert for protein kodet av denne mRNA, Gag 19. Det er begrensninger til bruken av FISH / IF co-analyser som er knyttet til antistoff valg og tilgjengelighet. Optimalisering av den beste kombinasjonen av primære og sekundære antistoffer, og deres konsentrasjoner, vil ta tid å optimalisere (se Tabell 1 &amp; 2). Antistoffer laget av hybridomas eller produsert av store selskaper kan ha konsentrasjoner som varierer alt fra 01:02 til 1:2000, men pass på å følge retningslinjene gitt av produsenten for best resultat. Verten der antistoff er produsert må også tas under vurdering. Mixing sau med geit antistoffer bør også unngås i grunnskolen og videregående antistoffer som dette kombinasjonen resulterer i høy bakgrunn grunn til å kryss-arter anerkjennelse (data ikke vist). For Alexa-Fluor secondary antistoffer, kan konsentrasjonen bli brukt på 1:500 for nesten alle antistoff i settet. Den andre ulempen til FISH / IF co-analyser som beskrevet i denne rapporten er det fanger opp RNA på sitt sted ved steady-state, etter cellene har blitt fikset og permeabilized hjelp paraformaldehyde og vaskemiddel (figur 1). Imidlertid har RNA bildebehandling i levende celler er oppnådd gjennom en rekke måter 20-22, for det meste med variasjoner av virale RNA-genomer som er merket med fluorescerende proteiner som GFP. Men ekstra midler til å identifisere RNA lokalisering i levende celler fortsette å dukke opp. Disse nye metodene involvere tagging RNA ved hjelp av spinat 23, SNAP 24, eller MTRIP to. Disse teknikkene også lider av noen ulemper herunder kravet til permeabilize celler før du legger underlag, eller at en fraksjon må være konstruert for å tagge mRNA for detektere mRNA ved mikroskopi. Ja, de store Advantage av FISH analyser skissert i denne rapporten ligger i det faktum at den innfødte RNA er uendret fører til de mest fysiologisk relevante resultatene.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 18mm Dekkglass </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16% paraformaldehyde </td><td> JT Baker </td><td> S898-07 </td><td> For å gjøre 4%: Løs opp 20g i 500ml 1XDPBS ved 60 ° C med 5 dråper NaOH. pH til 7,2 av varmen og butikken ved -20 ° C. Ikke overstige 70 ° C! </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Eluer Gel Extraction Kit </td><td> Roche </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA Merking Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> Transkripsjon T7 RNA Polymerase </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Raske Spin Kolonner </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase jeg </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNase OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoriserende Antistoff Enhancer Sett til DIG Detection # 4 (blokkering løsning) </td><td> Roche </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor sekundære antistoffer </td><td> Invitrogen </td><td> Se tabell 2 </td><td></td></tr><tr><td> Hybridisering Oven </td><td> Boekel Scientific </td><td> Model 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Microslides </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 1. Identifikasjon av spesifikke reagenser og utstyr <table border="1"><tbody><tr><td> Arter av anti-DIG antistoff (fortynning, firma, katalognummer) </td><td> Farger </td><td> Alexa Fluor Brukt (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Mouse (1:500; Sigma, B7405) </td><td> grønn </td><td> Alexa Fluor 488 esel anti-mus (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> red </td><td> Alexa Fluor 594 esel anti-mus (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> blå </td><td> Alexa Fluor 647 esel anti-mus (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sauer (1:200; Roche, 11376623) </td><td> grønn </td><td> Alexa Fluor 488 esel anti-sau (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> red </td><td> Alexa Fluor 594 esel anti-sau (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> blå </td><td> Alexa Fluor 647 esel anti-sau (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Kombinasjoner av sekundære antistoffer og anti-DIG oppført med katalognummer og konsentrasjoner.

detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)

Virus som infiserer celler lokke fram konkrete endringer normale cellefunksjoner som tjener til å avlede energi og ressurser for virusreplikasjon. Mange aspekter av vertscellen funksjon er rekvirert av virus, vanligvis av uttrykket av viral genprodukter som rekrutterer vertscellen proteiner og machineries. Videre til virus ingeniør bestemte membran organeller eller koden på til mobile blemmer og motor proteiner målrette deler av cellen (under de novo infeksjon, virus co-opt molekylære motor proteiner å målrette kjernen; senere, under virus montering, vil de kapre mobilnettet machineries som vil hjelpe i monteringen av virus). Mindre blir forstått på hvordan virus, særlig de med RNA genom, koordinere intracellulær trafficking av både protein og RNA komponenter og hvordan de oppnår montering av smittsomme partikler på bestemte loci i cellen. Studiet av RNA lokalisering startet i tidligere arbeid. Utvikling lavere eukaryote embryos og nevrale celler ga viktig biologisk informasjon, og understreket også betydningen av RNA lokalisering i programmering av genuttrykk kaskader. Studien i andre organismer og celle-systemer har gitt tilsvarende viktig informasjon. Virus er obligate parasitter og må utnytte sine vertsceller å replikere. Dermed er det avgjørende å forstå hvordan RNA-virus retter sine RNA genomer fra kjernen, gjennom kjernefysiske pore, gjennom cytoplasma og videre til en av sine endelige destinasjoner, til avkom viruspartikler 1. FISH fungerer som et nyttig verktøy for å identifisere endringer i steady-state lokalisering av virale RNA. Når det kombineres med immunfluorescens (IF) analyse 22, FISH / IF co-analyser vil gi informasjon om samlokalisering av proteiner med viral RNA tre. Denne analysen gir derfor et godt utgangspunkt for å teste for RNA-protein interaksjoner med andre biokjemiske eller biofysisketester 4,5, siden samlokalisering i seg selv er ikke nok bevis til å være sikker på en interaksjon. I studere viral RNA lokalisering ved hjelp av en metode som dette, har rikelig informasjon er gjort på begge viral og cellulære RNA menneskehandel hendelser 6. For eksempel produserer HIV-1 RNA i kjernen av infiserte celler, men RNA er bare oversatt i cytoplasma. Når en nøkkel viral protein mangler (Rev) 7, har FISH av viral RNA avslørte at blokken til virusreplikasjon skyldes tilbakeholdelse av HIV-1 genomisk RNA i kjernen 8. Her presenterer vi metoden for visuell analyse av viral genomisk RNA in situ. Metoden gjør bruk av en merket RNA probe. Denne sonden er konstruert for å være komplementær til de virale genomisk RNA. Under in vitro syntese av antisens RNA probe, det ribonukleotid som er modifisert med digoxigenin (DIG) er inkludert i en in vitro transcription reaksjon. Når sonden har hybridisert til målet mRNA i cellene, vil etterfølgende antistoff merking trinn (figur 1) viser lokalisering av mRNA samt proteiner av interesse når du utfører FISH / IF.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH at JoVE.com

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

En fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH) metoden ble utviklet for å visuelt oppdage virus genomisk RNA bruker fluorescens mikroskopi. En sonde er laget med spesifisitet til de virale RNA som deretter kan identifiseres ved hjelp av en kombinasjon av hybridisering og immunfluorescens teknikker. Denne teknikken har den fordelen av å identifisere lokalisering av de virale RNA eller DNA ved steady-state, gi informasjon om kontroll av intracellulære virus menneskehandel hendelser.

Påvisning av virale RNA ved fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Purification (kvitre)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analyse av encellede gentranskripsjon av RNA Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Hele Mount RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoer

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; I situ</em&gt; Hybridisering i Whole Mount embryoer og cellehistologi Tilrettelagt for Marine Elasmobranchs

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse av mRNA molekyler med fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Kombinert DNA-RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH) for å studere X kromosom inaktivering i Differensiert Kvinne Mouse Embryonale stamceller

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Hurtig Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering Protokoll for Xist RNA Kombinert med Immunfluorescens av Histone Modification i X-kromosom inaktivering

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Enkel metode for fluorescens DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering til knust Kromosomer

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Påvisning av RNA-bindende proteiner etter<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down i adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...