Name: detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)
Uploaded: 2012-05-05T14:00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH at JoVE.com

Авторы выражают благодарность прошлого и настоящего членов лаборатории за вклад в развитие методологии, изложенной здесь и Алан Кокрановского за советом. LA является получателем канадских институтов здравоохранения (CIHR) исследовательских стипендий и AJM поддерживается премии карьеры Фрейзер, Monat и Макферсона. Работа выполнена при поддержке гранта от CIHR (грант № СС-56974).

1. Подготовка зонда <ol><li> Дайджест 1 мкг в векторном транскрипции пробирке, ПКС (+) пол 236nt 9 с Kpn1 фермента при 37 ° С в течение 1 часа и запустить продукт линеаризованной ДНК в агарозном геле. Фрагмент должна быть около 2500 базисных пунктов. </li><li> Вырезать фрагмент из геля и очищают использовании Roche Micro элюировать гель Добыча Kit (все реагенты, используемые перечислены в Таблице 1). Выполните окончательное элюирование в 30 мкл буфера для элюции. Выполните 5 мкл продукта на агарозном геле для проверки очистки. </li><li> Смешайте в пробирке транскрипции реакции (см. рецепт ниже), используя Рош DIG РНК маркировке комплекта и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 2 часов. </li></ol> В ответ транскрипции пробирке: <table border="1"><tbody><tr><td> Линеаризованной ДНК </td><td> 23 мкл </td></tr><tr><td> 1X DIG РНК маркировке смеси (Roche) </td><td> 4 мкл </td></tr><tr><td> 1X Траnscription буфер </td><td> 8 мкл </td></tr><tr><td> 20U РНКазы OUT </td><td> 1 мкл </td></tr><tr><td> 80У Т7 РНК-полимеразы </td><td> 4 мкл </td></tr><tr><td> Общий </td><td> 40 мкл </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Добавить 228 U из ДНКазы I и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 15 мин. </li><li> Остановить реакцию добавлением EDTA рН от 8,0 до конечной концентрации 20 мМ. </li><li> Очисти реакции с помощью быстрого Столбцы Спин от Roche, указанных изготовителем. </li><li> Очистите датчик от осадков с 1/10 объема DEPC обработанных 3М NaOAc рН 5,2 и 2,5 объемов ледяной 95% этанола. Смешать и инкубировать при температуре -80 ° C в течение 30 минут, чтобы за одну ночь. </li><li> Центрифуга зонда в течение 15 мин при 4 ° С на 15000 х г. </li><li> Удалить супернатант и промыть осадок в ледяной 70% этанола. Центрифуга в течение 5 мин при 4 ° C при 15000 х г. </li><li> Удалить супернатант и высушите осадок. Ресуспендируют гранул в 50 мкл WВодный (ДНКазы / РНКазы бесплатно), содержащей 10 U Invitrogen РНКазы OUT. </li><li> Оценка концентрации зонда спектрофотометрически (мера РНК при 260 нм), и разбавить до концентрации 5 нг / мкл. Хранить в аликвоты при -20 ° С для краткосрочного использования или -80 ° C для длительного хранения. Рекомендуется выполнять в том сравнений анализ так сохранения аликвоту для этого. </li></ol> 2. Сотовые фиксации <ol><li> Это изначально важно семена прилипшие клетки на необработанные, стерильные покровные стекла, так что окончательный слияния на сбор составляет примерно 70-80%. Для не прилипшие клетки растут как обычно, и когда будете готовы к сбору, инкубировать их покровные, которые были обработаны с 0,01% в / о поли-L-лизина (Sigma-Aldrich, Inc) в течение 1 часа. Для типичного 12-и полистирол культуре ткани пластины (3,8 см 2), 150 000 клеток (например, HeLa) высевают на 24 часов до трансфекции. Номера прилипшие клетки могут быть инфицированы или трансфекции, как обычно, и позволила объявлениеЗдесь в стеклянной крышкой скользит перед фиксацией 3. </li><li> Откажитесь от средств массовой информации и промыть клетки 1X фосфатном буферном растворе, подготовленный в дистиллированной воде (DPBS) в течение 1 мин. Диэтилпирокарбонатом (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc), обработанные 1X PBS также могут быть использованы, однако необработанные PBS не может, как она может содержать РНКазы ферментов. </li><li> Откажитесь от PBS и добавить 4% параформальдегида, достаточно, чтобы покрыть клетки полностью. Выдержите в течение 15-20 мин. </li><li> Откажитесь от paraformaldeyhyde и промыть клетки 1X DPBS в течение 1 мин. </li><li> Откажитесь от DPBS и добавить 0,1 М глицин (растворяется в 1X DPBS). Инкубировать 10 мин. </li><li> Откажитесь от глицина и промыть клетки 1X DPBS в течение 1 мин. </li><li> Откажитесь от DPBS и добавить 0,2% Triton-X (1X, растворенных в DPBS). Выдержите в течение 5-10 мин. Если окрашивания ядрышек или ядерные белки оболочки, permeabilize с Тритон Х-100 не более чем на 5 минут или белка локализация станет расплывчатым. </li><li> Отменить Тритон Х-100 и мыть один раз в1X DPBS в течение 1 мин. </li><li> Для длительного хранения, заменить PBS с 70% этанола и хранят при температуре 4 ° C в течение четырех месяцев. Кроме того, еще раз промыть с 1X DPBS и перейти на рыбу. </li></ol> 3. Флуоресценции в гибридизация (FISH) <ol><li> Если покровные хранились в этанол, заменить этиловый спирт с 1X DPBS и позволяют клеткам увлажняет в течение 30 мин. Регидратации можно сделать на ночь, если покровные хранятся при температуре 4 ° C. </li><li> Вымойте покровных с 1X DPBS в течение 1 мин. </li><li> Подготовка слайдов для инкубации на покровные, заботясь, чтобы очистить и маркировать их хорошо. </li><li> Для 18мм покровное, добавить 50 мкл ДНКазы решение (25 ЕД / покровное, имеющиеся в продаже) на слайде. Добавить покровное, будучи уверенным, чтобы поместить его клетку вниз, и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре. </li><li> Вымойте покровных с 1X DPBS в течение 1 мин. </li><li> Добавить 50 мкл смеси гибридизации (см. рецепт ниже) на покровное наслайдов и инкубировать стороны покровного ячейку вниз в течение 16-18 часов при температуре 42 ° C. Инкубационный должны быть выполнены в лоток, содержащий 50% формамида, 2X ГНПП смеси (12,5 мл деионизованной формамида, 2,5 мл 20х ГНПП, 10 мл воды). </li></ol> Гибридизация Mix (для одного покровное, 50 мкл): <table border="1"><tbody><tr><td> Количество акций </td><td> Материал (в конечной концентрации) </td></tr><tr><td> 25 мкл </td><td> Формамид, 50% (деионизированной, любой источник) </td></tr><tr><td> 5 мкл (10 мг / мл) </td><td> тРНК, 1 мг / мл (Sigma-Aldrich, Inc) </td></tr><tr><td> 5 мкл (20х) </td><td> ГНПП, 2X </td></tr><tr><td> 5 мкл (в 50 раз) </td><td> Denharts, 5X </td></tr><tr><td> 0,125 мкл (5 единиц) </td><td> РНКазы OUT </td></tr><tr><td> 5 мкл (25 нг 5 нг / мкл) </td><td> Зонд </td></tr><tr><td> 5 мкл </td><td> H 2 O DEPC, чтобы сделать окончательныйОбъем 50 мкл </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> Инкубируйте покровные клетки вниз в 50 мкл 50% формамид (разводится в 1X DPBS) в течение 15 мин при 42 ° C. </li><li> Вымойте покровные дважды в 2х ГНПП путем инкубации их клетки вниз в 50 мкл 2х ГНПП (20X ГНПП разводят в 1X DPBS) в течение 5 минут каждый при 42 ° C. </li><li> Промойте в покровных 1X DPBS в течение 1 мин. </li></ol> 4. Окрашивание иммунофлуоресценции <ol><li> Блок покровные, размещая их клетки вниз в 50 мкл 1X Roche блокирование решения (10X Roche блокирующий раствор разводят в 1X DPBS) в течение 30 мин. </li><li> Инкубируйте покровные клетки стороны вниз в 50 мкл первичных антител решение в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Anti-DIG антител следует развести по направлению производителя в 1X блокирование решения. Если другие антитела, которые используются для окрашивания белков, они могут быть добавлены в правильной концентрации при условии, что все антитела, используемые, полученных из различных спецификации хостх годов. </li><li> Вымойте покровные в течение 10 мин в 1X DPBS. </li><li> Инкубируйте покровные клетки стороны вниз в 50 мкл вторичных решение антител в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Alexa Fluor-конъюгированных антител (Invitrogen) могут быть использованы для создания цветовой гаммы и используются в 1:500 в блокирующем растворе 1X, 1X DPBS. </li><li> Вымойте покровные два раза по 10 минут в каждом из 1X DPBS. </li><li> Высушите стороны покровные клетки на ватмане. Будьте уверены, чтобы покрыть покровные, чтобы избежать воздействия света и отбеливания. </li><li> Когда вся жидкость испарилась, смонтировать покровные на свежие слайды, используя 8 мкл ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc.) Мягко нажмите вниз покровное для устранения пузырьков воздуха. </li><li> Применение лака для ногтей по краям покровного стекла, чтобы закрепить его на месте. </li><li> Визуализация РНК и белков микроскопии также решающее значение для успеха этого метода. Настройки на микроскоп использовали могут способствовать или препятствовать визуализации, так что ключ, которыйНастройки на микроскопе правильно установить и быть последовательными от образца к образцу в данном эксперименте. Подробную информацию о настройках микроскопа, оптики и антител комбинации см. ссылки 1,10. </li></ol> 5. Представитель Результаты Например вирусной РНК окрашивания можно увидеть на рисунке 2. Вирусной РНК ВИЧ-1 видно по всей цитоплазме отображается диффузно по большей части, хотя и небольшой цитоплазматических punctae не являются редкостью. Специфика можно увидеть, сравнив положительных клеток в окружающие клетки, которые не проявляют флуоресценции. Как уже упоминалось во введении, ВИЧ-1, что не хватает регуляторный белок Rev производит РНК, которая сохраняется в ядре: это может быть представлен в виде ярких сигнала в ядре, а также отсутствие сигнала флуоресценции РНК в цитоплазме. Избыточная экспрессия клеточных белков также может смещения распределения ВИЧ-1 РНК вируса. На рисунке 2 </сильный&gt;, гиперэкспрессия белков, вовлеченных в торговлю эндосом пузырька (например, Rab7 взаимодействующих лизосомальных белков (RILP) 11 или N-терминальной удален RILP (RILPN) 11, и белки, которые сталкиваются с функцией динеин двигателя [например p50/dynamitin 1 12], мешают нормальной стационарной локализации вирусной РНК генома, как это определено FISH анализ RILP выражение приводит к повторной локализации вирусной РНК геномная к организации микротрубочек центр (КТВМ) 13;. RILPN рассеивает поздние эндосомы в Цитоплазма в связи с невозможностью привязки к P150 Клееный из динеин автотранспортного комплекса 14 и p50/dynamitin блоков большой субъединицы динеин двигателя и выбросы поздние эндосомы, а также вирусные и геномной РНК ВИЧ-1, структурные белки периферии клетки 1 (рис. 2). манипуляции стационарного локализации вирусной РНК генома, основной вклад в заразностивирусных частиц, будет иметь решающее значение для последующего развития терапии. В наших руках, вирусная РНК появляется в клетке уже 3 часа после трансфекции и инфекции 10 и становится легко наблюдать на этой рыбы технику на 12 часов. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> Рисунок 1. Блок-схема протокола FISH / IF совместного анализа. Клетки, выращенные на покровных и затем фиксировали параформальдегида. Лечение глицина и Triton-X осуществляется до клетки, либо используются для FISH / IF или хранятся в 70% этанола для хранения. Клетки для обезвоженной хранения регидратации в 1X DPBS (DEPC обработанных PBS), прежде чем перейти к FISH / IF. Клетки обрабатывали ДНКазы I и оставляют на ночь для гибридизации с зондом. После гибридизации завершения клетки промывают формамида, а также с ГНПП, а окончательное 1X DPBS полоскания. Блокирование решение применяется к клеткам, а затем инкубации спервичных антител. После мытья вторичных антител применяются. Два последних моет в 1X DPBS завершения процедуры окрашивания, где на покровные сушат и установлены на салазках для работы с изображениями. <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> Рисунок 2. Представитель результатов с помощью FISH / IF совместного анализа.) ВИЧ-1 трансфекции в клетки HeLa, а в некоторых случаях с конструкциями, которые вызывают гиперэкспрессии клеточных белков (RILP, p50/Dynamitin и RILPΔN (амино-терминал удаление мутант)) . FISH / IF совместного анализа была выполнена: РНК, выявленных в зеленой либо G3BP или LAMP1 (красный), чтобы отличить. Б) ВИЧ-1, выражается в HeLa и собранные в различные моменты времени. Вирусные РНК выражение отслеживается в зеленый, а клеточный белок, hnRNP A1, окрашивается в красный цвет. Размер баров 10 мкм. Изображения, измененные из ссылки 1 (выбрать данные из панелей; RILP, p50/Dynamitin и RILP deltaN)и 17 (группа В).

<ol>
	<li>Lehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+transport+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomic+RNA+and+viral+production+are+dependent+on+dynein+motor+function+and+late+endosome+positioning.">Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning.</a> J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).</li><li>Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+mRNA+interactions+with+RNA+granules+during+translation+initiation+inhibition.">Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition.</a> PLoS One. 6, e19727 (2011).</li><li>Abrahamyan, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Staufen1+ribonucleoproteins+prevent+formation+of+stress+granules+but+favour+encapsidation+of+HIV-1+genomic+RNA.">Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA.</a> J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).</li><li>Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+visualization+of+the+interactions+between+HIV-1+Gag+and+the+cellular+RNA-binding+protein+Staufen1.">Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1.</a> Retrovirology. 7, 41-41 (2010).</li><li>Vercruysse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cooperative+Rev+protein-protein+interactions+on+Rev+responsive+RNA+by+fluorescence+resonance+energy+transfer.">Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer.</a> RNA Biol. 8, 316-324 (2011).</li><li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+mRNA+export:+insights+from+virology.">Nuclear mRNA export: insights from virology.</a> Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).</li><li>Cmarko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rev+inhibition+strongly+affects+intracellular+distribution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNAs.">Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs.</a> J Virol. 76, 10473-10484 (2002).</li><li>Ajamian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+roles+for+UPF1+in+HIV-1+RNA+metabolism+and+translation.">Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation.</a> RNA. 14, 914-927 (2008).</li><li>Beriault, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+late+role+for+the+association+of+hnRNP+A2+with+the+HIV-1+hnRNP+A2+response+elements+in+genomic+RNA,+Gag,+and+Vpr+localization.">A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization.</a> J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).</li><li>Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+remodels+the+nuclear+pore+complex.">HIV-1 remodels the nuclear pore complex.</a> J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).</li><li>Jordens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rab7+effector+protein+RILP+controls+lysosomal+transport+by+inducing+the+recruitment+of+dynein-dynactin+motors.">The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors.</a> Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).</li><li>Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+imaging+reveals+a+peroxisomal+reticulum+in+living+cells.">Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).</li><li>Levesque, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+HIV-1+RNA+is+mediated+by+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A2+expression+and+impacts+on+viral+assembly.">Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly.</a> Traffic. 7, 1177-1193 (2006).</li><li>Rocha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+sensor+ORP1L+contacts+the+ER+protein+VAP+to+control+Rab7-RILP-p150+Glued+and+late+endosome+positioning.">Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning.</a> J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).</li><li>Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Rev+function+by+a+dominant-negative+mutant+of+Sam68+through+sequestration+of+unspliced+RNA+at+perinuclear+bundles.">Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles.</a> J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).</li><li>Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hRIP,+a+cellular+cofactor+for+Rev+function,+promotes+release+of+HIV+RNAs+from+the+perinuclear+region.">hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region.</a> Genes Dev. 18, 23-34 (2004).</li><li>Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+induces+the+cytoplasmic+retention+of+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A1+by+disrupting+nuclear+import:+implications+for+HIV-1+gene+expression.">Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression.</a> J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).</li><li>Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+rev+trans-activator+acts+through+a+structured+target+sequence+to+activate+nuclear+export+of+unspliced+viral+mRNA.">The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA.</a> Nature. 338, 254-257 (1989).</li><li>Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+destinies:+degradation,+targeting,+assembly,+and+endocytosis+of+HIV+Gag.">Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag.</a> AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).</li><li>Molle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+trafficking+of+HIV-1+gag+and+genomic+RNAs+regulates+viral+egress.">Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress.</a> J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+coimaging+of+the+genomic+RNAs+and+Gag+proteins+of+two+lentiviruses.">Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses.</a> J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li><li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions.">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007 (2011).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

FISH / IF совместного анализа является надежным методом для визуализации вирусной РНК в клетках, которая в настоящее время уточняется 9,15,16. В течение нескольких лет, мы разработали более совершенный метод окрашивания для РНК. Этот метод может быть использован на широкий спектр типов клеток при условии зонд специфичен для РНК-мишени 17. Называя зонд с DIG, мы способны визуализировать РНК простым окрашиванием. При окрашивании на РНК и белков в сочетании, FISH / IF совместного анализа стать мощным инструментом для наблюдения клеточных структур и белков / РНК локализации. Специфика выявления РНК достаточно высок. Это показано на рисунке 2. В некоторых из оригинальных работ, которые направлены на вирусную РНК геномная локализация, FISH установлено, что отсутствие Rev ловушку вирусной РНК в ядре 18. Так как эта, обильная новая информация о вирусных локализации геномной РНК была получена использованием techniquэлектронной изложены здесь. По гиперэкспрессией белка клеточного, конкретных групп населения, и не все из вирусной РНК может быть принужден к локализации в различных регионах ячейки. RILP гиперэкспрессия, который похож на фенотип, полученные при hnRNP A2 исчерпывается миРНК ВИЧ-1-экспрессирующие клетки 13, приводит к тому, РНК заметно накапливаться в КТВМ. Геномной РНК вируса могут быть прижаты к периферии клетки, отключив минус-концу белка двигателя, динеин: p50/Dynamitin гиперэкспрессия или нокдаун динеин тяжелой цепи 1 приводит к освобождению вирусного генома РНК из внутриклеточных доменов сотовой периферии ( Рисунок 2). Мутант RILP, RILPΔN, которые уже не связывает динеин двигателя, рассеивается эндосомы (помечены LAMP1) в цитоплазму, потому что они больше не активно локализованы на juxtanuclear области. Эти результаты указывают на понятие пластикового населения РНК ВИЧ-1 генома и, в частности, что различные бассейны ВИЧ-1 геномаРНК существует с иногда идентифицировать роль в репликации вируса. Эти же понятия уже определены для белка, кодируемого этой мРНК, Gag 19. Существуют ограничения на использование FISH / IF совместного анализа, связанные с выбором антител и доступность. Оптимизация лучшее сочетание первичных и вторичных антител и их концентрации, потребуется время, чтобы оптимизировать (см. Таблицу 1 и 2). Антитела из гибридом, или производятся крупными компаниями может иметь концентрациях, которые варьироваться от 1:2 до 1:2000, но обязательно следуйте указаниями производителя для достижения наилучших результатов. Хозяина, в котором антитела производятся также должны быть приняты в стадии рассмотрения. Смешивание овец с козьими антителами также следует избегать в начальной и средней антител, так как это сочетание приводит к высоким фоном из-за перекрестного признания видов (данные не представлены). Для Alexa Fluor-secondaры антител, концентрации могут быть использованы при 1:500 практически для любых антител в наборе. Другой недостаток FISH / IF совместного анализа, как описано в настоящем докладе, это отражает РНК в месте его нахождения в стационарном состоянии, после того, как клетки были зафиксированы и проницаемыми использованием параформальдегид и моющих средств (рис. 1). Тем не менее, РНК изображений в живых клетках было достигнуто с помощью различных средств 20-22, в основном используя вариации вирусных геномов РНК, помеченные флуоресцентными белками, такими как GFP. Тем не менее, дополнительные средства для выявления РНК локализация в живых клетках продолжать поверхность. Эти новые методы включают пометки РНК с помощью шпината 23, SNAP 24, или MTRIP 2. Эти методы также страдает от нескольких недостатков, включая требования к permeabilize клетки перед добавлением субстратов или часть должна быть разработана, чтобы отметить мРНК в целях обнаружения мРНК с помощью микроскопа. Действительно, основные ADVAntage из FISH анализа, изложенные в этом докладе, заключается в том, что родной РНК неизменной, ведущие к наиболее физиологически релевантные результаты.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> 18мм покровные </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16% параформальдегид </td><td> JT Baker </td><td> S898-07 </td><td> Для 4%: Растворите 20 г в 500 мл 1XDPBS при 60 ° С с 5 капель раствора NaOH. рН до 7,2 с огня и хранят при температуре -20 ° C. Не превышает 70 ° C! </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> Micro элюировать гель Добыча Kit </td><td> Roche </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG РНК маркировке Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> Транскрипция Т7 РНК-полимеразы </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Быстрый Столбцы Спин </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> ДНКазы I </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Гибко </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Формамид </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> тРНК </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> РНКазы OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Флуоресцентные антител Enhancer Набор для обнаружения DIG # 4 (блокирование решения) </td><td> Roche </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor вторичными антителами </td><td> Invitrogen </td><td> См. Таблицу 2 </td><td></td></tr><tr><td> Гибридизация печи </td><td> Научно Boekelentific </td><td> Модель 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Microslides </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> Таблица 1. Определение специфических реагентов и оборудования <table border="1"><tbody><tr><td> Виды анти-DIG антител (разбавление, компании, номер по каталогу) </td><td> Цвета </td><td> Alexa Fluor используемых (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Мышь (1:500; Sigma, B7405) </td><td> зеленый </td><td> Alexa Fluor 488 осел анти-мышь (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> красный </td><td> Alexa Fluor 594 осел анти-мышь (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> синий </td><td> Alexa Fluor 647 осел анти-мышь (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Овцы (1:200; Roche, 11376623) </td><td> зеленый </td><td> Alexa Fluor 488 осла против овец (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> красный </td><td> Alexa Fluor 594 осла против овец (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> синий </td><td> Alexa Fluor 647 осла против овец (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> Таблица 2. Комбинации вторичных антител и анти-DIG перечислены с номера по каталогу и концентрации.

detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH at JoVE.com

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Флуоресценции<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизации (FISH) был разработан метод визуального обнаружения вирусной геномной РНК с помощью флуоресцентной микроскопии. Зонд сделал со спецификой с вирусной РНК, которые затем могут быть идентифицированы с помощью комбинации гибридизации и иммунофлюоресценции техники. Этот метод имеет то преимущество, определения локализации вирусной РНК или ДНК в стационарном состоянии, предоставление информации по контролю за оборотом событий внутриклеточных вирусов.

Обнаружение вирусной РНК с помощью флуоресцентного<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Флуоресценция На месте Гибридизации (FISH) протокола в человеческой сперме

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Хроматина Изоляция очистки РНК (чирпа)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Анализ одноклеточных транскрипции гена РНК-флуоресцентный<em&gt; В Situ</em&gt; Гибридизация (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Всего горы РНК Флуоресцентные<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

РНК<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизации эмбрионов Всего в гору и сотовых гистологии адаптированный для морских хрящевых рыб

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

В сочетании ДНК-РНК Люминесцентная<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизация (FISH) по изучению Х-хромосома инактивации в Дифференцированный Женский эмбриональных стволовых клеток мыши

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Быстрый Люминесцентная<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация Протокола о Xist РНК в сочетании с Иммунофлуоресценции модификации гистонов в X-хромосоме инактивации

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Простой метод ДНК флуоресценции<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация, чтобы раздавил хромосом

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Обнаружение РНК-связывающих белков<em&gt; In Vitro</em&gt; РНК спускающее в адипоцитов культуры

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...