Name: detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)
Uploaded: 2012-05-05T14:00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH at JoVE.com

Författarna tackar tidigare och nuvarande medlemmar i labbet för bidrag till utvecklingen av den metod som beskrivs här och Alan Cochrane för rådgivning. LA är en mottagare av en kanadensisk Institutes of Health Research (CIHR) Doctoral Fellowship och AJM stöds av en Fraser, Monat och MacPherson Karriär Award. Detta arbete stöds av ett bidrag från CIHR (bidrag # MOP-56.974).

1. Sonden Framställning <ol><li> Digest 1 | ig av in vitro-transkription-vektor, pKS (+) pol 236nt 9 med Kpn1 enzym vid 37 ° C under 1 timme och köra den linjäriserade DNA-produkten på en agarosgel. Fragmentet bör vara ca 2500 bp. </li><li> Skära fragmentet ut från gelén och renades med användning av Roche Micro Eluera Gel Extraction Kit (samtliga reagenser är listade i tabell 1). Utföra den slutliga elueringen i 30 | il elueringsbuffert. Köra 5 pl av produkten på en agarosgel för att verifiera rening. </li><li> Blanda en in vitro transkriptionsreaktion (se recept nedan) med användning av Roche DIG-RNA märkningskit och inkubera vid 37 ° C under 2 timmar. </li></ol> In vitro transkriptionsreaktion: <table border="1"><tbody><tr><td> Linjäriserade DNA </td><td> 23 pl </td></tr><tr><td> 1X DIG RNA märkning mix (Roche) </td><td> 4 il </td></tr><tr><td> 1X Transcription buffert </td><td> 8 | il </td></tr><tr><td> 20U RNase OUT </td><td> 1 il </td></tr><tr><td> 80U T7 RNA-polymeras </td><td> 4 il </td></tr><tr><td> Totalt </td><td> 40 pl </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Tillsätt 228 U av DNas I och inkubera vid 37 ° C under 15 minuter. </li><li> Stoppa reaktionen genom tillsats av EDTA pH 8,0 till en slutlig koncentration av 20 mM. </li><li> Rena reaktionslösningen med hjälp av Quick Spin kolumner från Roche som anges av tillverkaren. </li><li> Rena sonden genom utfällning med 1/10 volym DEPC-behandlat 3 M NaOAc pH 5,2 och 2,5 volymer iskall 95% etanol. Blanda och inkubera vid -80 ° C under 30 min till över natten. </li><li> Centrifugera sonden under 15 min vid 4 ° C vid 15.000 x g. </li><li> Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten i iskall 70% etanol. Centrifugera igen under 5 min vid 4 ° C vid 15.000 x g. </li><li> Avlägsna supernatanten och torka pelleten. Återsuspendera pelleten i 50 | il water (DNas / RNas fri) innehållande 10 U Invitrogen RNas OUT. </li><li> Uppskatta koncentrationen av sonden genom spektrofotometri (mått RNA vid 260 nm), och utspädd till en koncentration av 5 ng / | il. Lagra i alikvoter vid -20 ° C för kortvarig användning, eller -80 ° C under långtidslagring. Det rekommenderas att utföra bland assay Jämförelser så bevara en alikvot för detta. </li></ol> 2. Cell Fixation <ol><li> Det är initialt viktigt att utsäde fastsittande celler på obehandlade, sterila täckglas så att den slutliga sammanflytning vid skörd är ca 70-80%. För icke-adherenta celler, växer som normalt och när de är färdiga att samla in, inkubera dem med täckglas som har behandlats med 0,01% vikt / volym poly-L-lysin (Sigma-Aldrich, Inc.) under 1 timme. För en typisk 12-brunnars polystyren vävnadsodlingsplatta (3,8 cm 2), 150.000 celler (t.ex. HeLa) utströks vid 24 timmar före transfektion. Icke-adherenta celler kan infekteras eller transfekteras som vanligt och tilläts adhär för att glas täckglas före fixering 3. </li><li> Kasta media och tvätta cellerna med 1X fosfatbuffrad saltlösning upprättats i dubbla destillerat vatten (DPBS) under 1 minut. Dietylpyrokarbonat (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc.)-behandlade 1X PBS kan också användas, kan dock obehandlad PBS inte så den kan innehålla RNas enzymer. </li><li> Kassera PBS och tillsätt 4% paraformaldehyd, tillräckligt för att täcka cellerna fullständigt. Inkubera i 15-20 min. </li><li> Kasta paraformaldeyhyde och tvätta cellerna med 1X DPBS för 1 min. </li><li> Kassera DPBS och tillsätt 0,1 M glycin (upplöst i 1 x DPBS). Inkubera under 10 min. </li><li> Kasta glycin och tvätta cellerna med 1X DPBS för 1 min. </li><li> Kassera DPBS och tillsätt 0,2% Triton-X (upplöst i 1 x DPBS). Inkubera under 5-10 minuter. Om färgning av nukleolära eller nukleär höljesproteiner, permeabilisering med Triton X-100 inte mer än 5 minuter eller proteinet lokaliseringen blir diffus. </li><li> Kassera Triton X-100 och tvätta en gång i1X-DPBS under 1 min. </li><li> För långtidsförvaring, ersätt PBS med 70% etanol och förvara vid 4 ° C i upp till fyra månader. Alternativt, tvätta en gång med 1x DPBS och fortsätt att fiska. </li></ol> 3. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) <ol><li> Om täckglasen lagrades i etanol, ersätta etanol med 1 x DPBS och tillåta cellerna att rehydratisera i 30 min. Rehydrering kan göras över natten vid täckglasen lagras vid 4 ° C. </li><li> Tvätta täckglasen med 1x DPBS för 1 min. </li><li> Förbered bilder för att inkubera täckglasen på, var noga med att rengöra och märka dem väl. </li><li> För en 18mm täckglas, tillsätt 50 pl DNas lösning (25 enheter / täckglas, kommersiellt tillgängliga) till bilden. Lägg till täckglaset, är säker på att placera den cell nedåt och inkubera det för 15 minuter vid rumstemperatur. </li><li> Tvätta täckglasen med 1x DPBS för 1 min. </li><li> Tillsätt 50 pl hybridiseringsblandning (se recept nedan) per täckglas påen bild och inkubera sidan täckglaset cellen ner för 16-18 timmar vid 42 ° C. Inkubationen bör utföras i en bricka som innehåller en 50% formamid, 2X SSPE blandning (12,5 ml avjoniserad formamid, 2,5 ml 20X SSPE, 10 ml vatten). </li></ol> Hybridiseringsblandning (för en täckremsa, 50 | il): <table border="1"><tbody><tr><td> Belopp i lager </td><td> Material (vid en slutlig koncentration) </td></tr><tr><td> 25 pl </td><td> Formamid, 50% (avjoniserat, någon källa) </td></tr><tr><td> 5 | il (10 mg / ml) </td><td> tRNA, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc.) </td></tr><tr><td> 5 | il (20X) </td><td> SSPE, 2 x </td></tr><tr><td> 5 | il (för 50X) </td><td> Denharts, 5X </td></tr><tr><td> 0,125 il (av 5 enheter) </td><td> RNas OUT </td></tr><tr><td> 5 pl (25 ng av 5 ng / | il) </td><td> Sond </td></tr><tr><td> 5 pl </td><td> H 2 O DEPC, så att den slutligavolym 50 | il </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> Inkubera täckglas cellen nedåt i 50 pl 50% formamid (utspädd i 1 x DPBS) i 15 min vid 42 ° C. </li><li> Tvätta täckglasen två gånger i 2X SSPE genom att inkubera dem cellen nedåt i 50 | il 2X SSPE (20X SSPE utspädd i 1X-DPBS) i 5 min vardera vid 42 ° C. </li><li> Tvätta täckglasen i 1X DPBS för 1 min. </li></ol> 4. Immunofluorescensfärgning <ol><li> Blockera täckglasen genom att placera dem cellen nedåt i 50 | il 1 X Roche blockeringslösning (10X Roche blockerande lösning späddes i 1 x DPBS) i 30 min. </li><li> Inkubera täckglas cellen nedåt i 50 | il primär antikropp-lösning under 1 timme vid 37 ° C. Anti-DIG-antikropp bör spädas enligt tillverkarens riktning i 1 x blockeringslösning. Om andra antikroppar används för att färga proteiner kan de läggas till rätta koncentrationen under förutsättning att alla begagnade antikroppar härrör från annan värd spectalet. </li><li> Tvätta täckglasen under 10 min i 1 x DPBS. </li><li> Inkubera täckglas cellen nedåt i 50 | il sekundär antikroppslösning under 1 timme vid 37 ° C. Alexa Fluor-konjugerade antikroppar (Invitrogen) kan användas för att generera en färgskala och används vid 1:500 i 1 x blockeringslösning, 1X-DPBS. </li><li> Tvätta täckglasen två gånger under 10 min vardera i 1 x DPBS. </li><li> Torka täckglas cellen uppåt på Whatman papper. Var noga med att täcka täckglasen att undvika exponering för ljus och blekning. </li><li> När all vätska förångas, montera täckglasen på färska objektglasen med 8 pl ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc.). Knacka försiktigt ner täckglaset för att eliminera eventuella luftbubblor. </li><li> Applicera nagellack till kanterna på täckglaset för att säkra det på plats. </li><li> Visualiseringen av RNA och proteiner från mikroskopitekniker är också kritisk för framgången hos denna teknik. Inställningar på den använda mikroskopet kan hjälpa eller hindra visualisering så det är nyckeln till attInställningarna på mikroskopet ställas in korrekt och överensstämma från ett prov till ett annat i ett givet experiment. För detaljerade mikroskopi inställningar optik och kombinationer antikroppar se referenser 1,10. </li></ol> 5. Representativa resultat Ett exempel på virala RNA-färgning kan ses i figur 2. Det virala RNA för HIV-1 ses i cytoplasman visas diffust för det mesta, men liten cytoplasma punctae är inte ovanliga. Specificiteten kan ses genom att jämföra positiva celler till omgivande celler som uppvisar ingen fluorescens. Såsom nämnts i inledningen, producerar HIV-1 som saknar den reglerande Rev-proteinet RNA som kvarhålles i kärnan: denna kan visualiseras som en ljus signal i kärnan, och en avsaknad av RNA fluorescenssignal i cytoplasman. Överexpression av cellulära proteiner har också förmåga att skifta fördelningen av de HIV-1 virala RNA. I figur 2 </stark&gt;, överexpression av proteinerna inblandade i endosomala vesikel handel (t.ex. Rab7-interagerande lysosomalt protein (RILP) 11 eller N-terminalt bort RILP (RILPN) 11, och proteiner som interfererar med dynein motorisk funktion [t.ex. p50/dynamitin 1, 12], interfererar med den normala steady state-lokalisering av de virala genomiska RNA: t enligt bestämning genom FISH analyser RILP uttryck leder till re-lokalisering av de virala genomiska RNA till mikrotubulus organisationen centrum (MTOC) 13,. RILPN dispergerar sena endosomer i cytoplasman på grund av oförmågan att binda till p150 Limmad av dynein motorn komplex 14 och p50/dynamitin block den stora subenheten av dynein motorn och frisätter endosomer sent men även det virala genomiska RNA och HIV-1-strukturella proteiner i cellen periferin 1 (Figur 2). manipulering av steady-state-lokalisering av de virala genomiska RNA: t, en viktig bidragsgivare till smittsamheten hosviruspartiklar, skulle vara nyckeln till eventuell utveckling av läkemedel. I våra händer, visas viralt RNA i cellen så tidigt som 3 timmar efter transfektion och infektion 10 och blir lätt iakttas av denna FISH-teknik genom 12 timmar. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> Figur 1. Flödesschema av protokollet för FISH / IF co-analyser. Cellerna odlas på täckglas och sedan fixeras med paraformaldehyd. Behandlingar av glycin och Triton-X utförs innan cellerna används antingen för FISH / IF-eller lagras i 70% etanol under lagring. Celler dehydrerade för lagring är rehydreras i 1X DPBS (DEPC-behandlad PBS) innan du fortsätter på FISH / IF. Cellerna behandlades med DNas I och lämnades över natten för att hybridisera med proben. Gång hybridisering är fullständig, tvättas cellerna med formamid, såväl som med SSPE, och en slutlig 1X-DPBS sköljning. Blockeringslösning påförs till cellerna, följt av inkubering medDe primära antikropparna. Efter tvättning sekundära antikroppar används. Två slutliga tvättningar i DPBS 1X-fullborda färgningsproceduren där på täckglasen torkas och monterades på objektglas för avbildning. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> Figur 2. Representativa resultat med användning av FISH / IF-co-analyser. A) HIV-1-transfekteras in i HeLa-celler och i vissa fall med konstruktioner som orsakar överexpression av cellulära proteiner (RILP, p50/Dynamitin och RILPΔN (en amino-terminal deletionsmutant)) . FISH / Om samtidig analys utfördes: RNA identifieras i grönt med antingen G3BP eller LAMP1 (röd) att differentiera. B) HIV-1 uttrycks i HeLa-och uppsamlades vid olika tidpunkter. Viral RNA uttryck spåras i grönt medan det cellulära proteinet, hnRNP A1, färgas i rött. Storlek barer är 10 nm. Bilder modifierade från referenserna 1 (välj siffror från panel A, RILP, p50/Dynamitin och RILP deltaN)och 17 (panel B).

<ol>
	<li>Lehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+transport+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomic+RNA+and+viral+production+are+dependent+on+dynein+motor+function+and+late+endosome+positioning.">Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning.</a> J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).</li><li>Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+mRNA+interactions+with+RNA+granules+during+translation+initiation+inhibition.">Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition.</a> PLoS One. 6, e19727 (2011).</li><li>Abrahamyan, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Staufen1+ribonucleoproteins+prevent+formation+of+stress+granules+but+favour+encapsidation+of+HIV-1+genomic+RNA.">Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA.</a> J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).</li><li>Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+visualization+of+the+interactions+between+HIV-1+Gag+and+the+cellular+RNA-binding+protein+Staufen1.">Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1.</a> Retrovirology. 7, 41-41 (2010).</li><li>Vercruysse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cooperative+Rev+protein-protein+interactions+on+Rev+responsive+RNA+by+fluorescence+resonance+energy+transfer.">Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer.</a> RNA Biol. 8, 316-324 (2011).</li><li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+mRNA+export:+insights+from+virology.">Nuclear mRNA export: insights from virology.</a> Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).</li><li>Cmarko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rev+inhibition+strongly+affects+intracellular+distribution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNAs.">Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs.</a> J Virol. 76, 10473-10484 (2002).</li><li>Ajamian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+roles+for+UPF1+in+HIV-1+RNA+metabolism+and+translation.">Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation.</a> RNA. 14, 914-927 (2008).</li><li>Beriault, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+late+role+for+the+association+of+hnRNP+A2+with+the+HIV-1+hnRNP+A2+response+elements+in+genomic+RNA,+Gag,+and+Vpr+localization.">A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization.</a> J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).</li><li>Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+remodels+the+nuclear+pore+complex.">HIV-1 remodels the nuclear pore complex.</a> J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).</li><li>Jordens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rab7+effector+protein+RILP+controls+lysosomal+transport+by+inducing+the+recruitment+of+dynein-dynactin+motors.">The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors.</a> Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).</li><li>Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+imaging+reveals+a+peroxisomal+reticulum+in+living+cells.">Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).</li><li>Levesque, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+HIV-1+RNA+is+mediated+by+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A2+expression+and+impacts+on+viral+assembly.">Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly.</a> Traffic. 7, 1177-1193 (2006).</li><li>Rocha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+sensor+ORP1L+contacts+the+ER+protein+VAP+to+control+Rab7-RILP-p150+Glued+and+late+endosome+positioning.">Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning.</a> J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).</li><li>Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Rev+function+by+a+dominant-negative+mutant+of+Sam68+through+sequestration+of+unspliced+RNA+at+perinuclear+bundles.">Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles.</a> J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).</li><li>Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hRIP,+a+cellular+cofactor+for+Rev+function,+promotes+release+of+HIV+RNAs+from+the+perinuclear+region.">hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region.</a> Genes Dev. 18, 23-34 (2004).</li><li>Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+induces+the+cytoplasmic+retention+of+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A1+by+disrupting+nuclear+import:+implications+for+HIV-1+gene+expression.">Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression.</a> J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).</li><li>Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+rev+trans-activator+acts+through+a+structured+target+sequence+to+activate+nuclear+export+of+unspliced+viral+mRNA.">The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA.</a> Nature. 338, 254-257 (1989).</li><li>Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+destinies:+degradation,+targeting,+assembly,+and+endocytosis+of+HIV+Gag.">Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag.</a> AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).</li><li>Molle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+trafficking+of+HIV-1+gag+and+genomic+RNAs+regulates+viral+egress.">Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress.</a> J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+coimaging+of+the+genomic+RNAs+and+Gag+proteins+of+two+lentiviruses.">Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses.</a> J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li><li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions.">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007 (2011).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

FISH / IF co-analyser är en pålitlig metod för att visualisera viralt RNA i celler som nu har förfinats 9,15,16. Under flera år har vi utvecklat en förfinad metod för färgning för RNA. Denna teknik kan användas på en mängd olika celltyper, förutsatt att sonden är specifik för mål-RNA 17. Genom att märka sonden med DIG, vi kan visualisera RNA genom en enkel färgning. Vid färgning av RNA och andra proteiner kombineras, FISH / IF co-analyser blivit ett kraftfullt verktyg för att observera cellulära strukturer och protein / RNA-lokalisering. Specificiteten hos RNA-detektion är ganska hög. Detta illustreras i figur 2. I några av de ursprungliga arbete som fokuserar på viral genomisk RNA lokalisering, FISH konstaterat att bristen på Rev fångade viralt RNA i kärnan 18. Sedan detta har riklig ny information om viral genomisk RNA lokalisering erhållits med hjälp av technique som beskrivs här. Genom överexpression cellulära proteiner, kan specifika populationer-och inte helt av det virala RNA tvingas att lokalisera till olika regioner av cellen. RILP överexpression, som liknar den fenotyp som erhålls när hnRNP A2 är uttömda av siRNA i HIV-1-uttryckande celler 13, orsakar det RNA som synligt ackumulera vid MTOC. De virala genomiska RNA: t kan skjutas till cellen periferin genom att inaktivera minus-änden motorn proteinet, dynein: p50/Dynamitin överexpression eller knockdown av dynein tungkedjiga 1 resulterar i frisättning av viralt genomiskt RNA från intracellulära domäner till den cellulära periferin ( figur 2). En mutant av RILP, RILPΔN, som inte längre binder dynein motorn, endosomer skingrar (märkt med LAMP1) i cytoplasman eftersom de inte längre aktivt lokaliseras till juxtanuclear domäner. Dessa resultat pekar på begreppet plast population av HIV-1 genom-RNA och framför allt att olika pooler av HIV-1 genomisktRNA finns med ibland identifierbara roller i den virala replikationscykeln. Samma begrepp har redan identifierats för det protein som kodas av detta mRNA, Gag 19. Det finns begränsningar av användningar av FISH / Om samtidig analyser som är relaterade till antikroppar val och tillgänglighet. Optimeringen av den bästa kombinationen av primära och sekundära antikroppar och deras koncentrationer, kommer att ta tid för att optimera (se tabell 1 och 2). Antikroppar gjorda av hybridom eller produceras av stora företag kan ha halter som varierar allt från 1:2 till 1:2000, men tänk på att följa de riktlinjer som tillverkaren för bästa resultat. Den värd i vilken antikroppen produceras måste också tas under övervägande. Blandning får med getantikroppar bör också undvikas i primära och sekundära antikroppar eftersom denna kombination resulterar i hög bakgrund på grund av att korsa-arter erkännande (data visas ej). För Alexa-Fluor secondary antikroppar kan koncentrationen användas vid 1:500 till nästan vilken som helst antikropp i uppsättningen. Den andra nackdelen med FISH / IF co-analyser som beskrivs i denna rapport är det fångar RNA vid sitt läge vid steady-state efter celler har rättats och permeabiliseras med paraformaldehyd och rengöringsmedel (figur 1). Emellertid har RNA-avbildning i levande celler har uppnåtts genom en mängd olika medel 20-22, mest använda varianter av virala RNA-genom som är märkta med fluorescerande proteiner, såsom GFP. Men ytterligare medel för att identifiera RNA lokalisering i levande celler fortsätter till ytan. Dessa nya metoder engagera märka RNA med hjälp av spenat 23, SNAP 24 eller MTRIP 2. Dessa tekniker lider också av några nackdelar inklusive kravet på att permeabilisera cellerna före tillsats substrat eller som en molekyldel måste konstrueras för att märka den mRNA för detektering av mRNA genom mikroskopi. I själva verket, den huvudsakliga Advantage av FISH analyser som beskrivs i denna rapport ligger i det faktum att personen RNA oförändrad leder till de mest fysiologiskt relevanta resultaten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 18 mm täckglas </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16% paraformaldehyd </td><td> JT Baker </td><td> S898-07 </td><td> För att göra 4%: Lös 20 g i 500 ml 1XDPBS vid 60 ° C med 5 droppar NaOH. pH-värdet till 7,2 av värmen och förvara vid -20 ° C. Inte överstiga 70 ° C! </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Eluera Gel Extraction Kit </td><td> Roche </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG-RNA Märkning Blanda </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> Transkription T7 RNA-polymeras </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Snabba spinnkolonner </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNas I </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X-DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNas OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescerande antikroppar Enhancer Set för DIG Detection # 4 (blockerande lösning) </td><td> Roche </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor sekundära antikroppar </td><td> Invitrogen </td><td> Se tabell 2 </td><td></td></tr><tr><td> Hybridiseringsugn </td><td> Boekel Sciskaplig </td><td> Modell 24.100 </td><td></td></tr><tr><td> Microslides </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 1. Identifiering av specifika reagens och utrustning <table border="1"><tbody><tr><td> Arter av anti-DIG-antikropp (utspädning, företag, katalognummer) </td><td> Färger </td><td> Alexa Fluor använt (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Mus (1:500, Sigma, B7405) </td><td> grön </td><td> Alexa Fluor 488 åsne-anti-mus (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> röd </td><td> Alexa Fluor 594 åsne-anti-mus (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> blå </td><td> Alexa Fluor 647 åsne-anti-mus (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Får (1:200, Roche, 11.376.623) </td><td> grön </td><td> Alexa Fluor 488 åsne-anti-får (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> röd </td><td> Alexa Fluor 594 åsne-anti-får (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> blå </td><td> Alexa Fluor 647 åsne-anti-får (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Kombinationer av sekundära antikroppar och anti-DIG-listas med katalognummer och koncentrationer som används.

detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)

Virus som infekterar celler framkallar vissa ändringar normala cellfunktioner som tjänar till att avleda energi och resurser för virusreplikation. Många aspekter av värdcellen funktion är beslag av virus, vanligen genom uttryck av virala genprodukter som rekryterar värdcellproteiner och maskinerier. Dessutom, för att virus ingenjören specifika membranreceptorer organeller eller taggen på att mobil vesiklar och proteiner motoriska målregioner hos cellen (under de novo-infektion, virus adjungera molekylära motorproteiner att rikta kärnan; senare, under virussammansättningen, kommer de kapa cellulär maskinerier som hjälper vid montering av virus). Mindre förstås på hur virus, i synnerhet med RNA genom, samordna intracellulära handel med både protein och RNA-komponenter och hur de uppnår montering av infektiösa partiklar i specifika loci i cellen. Studien av RNA lokalisering började tidigare arbete. Utveckla lägre eukaryota embryos och neuronala celler som viktig biologisk information, och även betonade vikten av RNA lokalisering vid planeringen av Cascades genuttryck. Studien i andra organismer och cellsystem har gett liknande viktig information. Virus är obligata parasiter och måste utnyttja sina värdceller att replikera. Således är det viktigt att förstå hur RNA-virus rikta deras RNA-genom från kärnan, genom nukleär por, genom cytoplasman och vidare till en av dess slutliga destination, till partiklar virusavkomma 1. FISH fungerar som ett användbart verktyg för att identifiera förändringar i steady-state lokalisering av viralt RNA. I kombination med immunofluorescens (IF) analys 22, FISH / IF co-analyser kommer att ge information om samlokalisering av proteiner med den virala RNA 3. Denna analys ger därför en bra utgångspunkt för att testa RNA-protein interaktioner med andra biokemiska eller biofysiskatester 4,5, eftersom co-lokalisering i sig är inte tillräckligt bevis för att vara säker på en interaktion. När man studerar viralt RNA lokalisering med hjälp av en metod som denna, har riklig information vunnits på både virala och cellulära RNA handel evenemang 6. Exempelvis producerar HIV-1 RNA i kärnan av infekterade celler men RNA-enbart translateras i cytoplasman. När en nyckel viralt protein som saknas (Rev) 7, har FISH av det virala RNA: t avslöjade att blocket på viral replikation beror på upprätthållande av HIV-1 genomiska RNA i kärnan 8. Här presenterar vi en metod för visuell analys av viralt genomiskt RNA in situ. Metoden gör användningen av en märkt RNA-prob. Denna sond är utformad för att vara komplementära till de virala genomiska RNA. Under in vitro-syntes av antisens-RNA-sond, ribonukleotiden som är modifierad med digoxigenin (DIG) ingår i en in vitro-transcrivning reaktion. När väl sonden har hybridiserats till mål-mRNA i celler, kommer efterföljande antikroppsmärkning steg (figur 1) visar lokaliseringen av mRNA såväl som proteiner av intresse när man utför FISH / IF.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH at JoVE.com

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

En fluorescens<em&gt; In situ</em&gt;-Hybridisering (FISH) metod utvecklades för att visuellt detektera virala genomiska RNA med fluorescensmikroskopi. En sond görs med specificitet för det virala RNA som sedan kan identifieras med användning av en kombination av hybridisering och immunofluorescens-tekniker. Denna teknik erbjuder fördelen att identifiera lokaliseringen av de virala RNA eller DNA vid steady-state, ger information om kontroll av intracellulära förlopp virus människohandel.

Detektering av viralt RNA genom Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Fluorescens På plats Hybridisering (FISH) Protokoll i mänskliga spermier

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Rening (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analys av encelliga gentranskription av RNA-lysrör<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Hel Mount RNA Lysrör<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering i hela Mount Embryon och Cell Histologi Anpassad för marina Elasmobranchii

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Kombinerad DNA-RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH) för att studera X-kromosom inaktivering i Differentierade Kvinna Mouse embryonala stamceller

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Snabb Fluorescerande<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering protokollet för Xist RNA Kombinerad med Immunfluorescens av histonmodifiering i X-kromosomen Inaktive

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Enkel metod för fluorescens-DNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering till kläm Kromosomer

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detektering av RNA-bindande proteiner genom<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA List i fettceller kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...