Name: generation of mice derived from induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2012-11-29T12:00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Støtte til KKB ble MJB, JLH og KLN levert av California Institute for regenerativ medisin, Pew Charitable Trusts Biomedical Scholars Program, Esther B. O&#39;Keeffe Family Foundation og Shapiro Family Foundation. KKB er en Donald E. og Delia B. Baxter Foundation fakultet Scholar.

Denne metoden ble brukt i forskningen rapportert i Boland et al. Nature. 461, 91-96 (2009). En 1. Utarbeidelse av Lentivirus Denne protokollen benytter doxycycline-induserbare lentiviral shuttle vektorer som koder for Oct4, Sox2, Klf4, og c-Myc under kontroll av en Teto respons element. Transgener aktiveres av revers tetracyklin trans-aktiverende protein, rtTAM2.2 16, som induserer omprogrammering faktor uttrykk i nærvær av doksycyklin. Dette systemet gjør det mulig for strengt kontrollert, høy uttrykk for omprogrammeringskostnader faktorer. De lentiviral vektorer som brukes her er selvstendig inaktivere og dermed kan ikke replikere følgende genomisk integrering. Men det utvises forsiktighet når du arbeider med lentiviruses og bør utføres i laboratorier kompatibel med BSL2 (USA) og S2 (Europa) standarder. <ol><li> Tine HEK293T celler og passasje minst en gang før transfection. Celler bør opprettholdes på subconfluent tetthet i HEK medium ved 37 ° C, 5% CO 2 i en fuktet miljø. Rutinemessig passasje celler hver 2 dager med en delt forholdet 01:06-01:10. </li><li> Seed ~ 8 x 10 6 HEK293T cells/T150 med 25 ml HEK medium. Bruk en T150 for hver lentivirus forberedelse. </li><li> Dagen etter transfektere HEK293T cellene ved kalsiumfosfat nedbør. (Merk: i våre hender kalsiumfosfat ventet rutinemessig resulterer i 80-90% transfeksjon effektivitet, men kan kationiske lipid transfeksjon reagenser som Lipofectamine 2000 også brukes). Forbered to 15 ml koniske rør for hvert virus å være forberedt. Merke rør &quot;A&quot; og &quot;B&quot;. Tube A, 10 ug av hver av: de lentiviral shuttle vektor koding omprogrammeringskostnader faktorer (eller rtTAM2.2), viral emballasje vektorer og plasmid som koder viruskapselen protein VSVg. Legg 186 pl 2 M CaCl 2 til Tube A, og bringe volumet til 1,5 ml med sterilt H 2 O. Strømpe B: 1,5 ml 2x HBS (pre-oppvarmet til romtemperatur). </li><li> Pipetter blandingen i strømpe A før det er en homogen løsning. Legg oppløsning A til oppløsning B dråpevis og la stå ved romtemperatur i 2-3 minutter. </li><li> Aspirer vekstmedium av HEK293T celler og erstatte med 22 ml forvarmet HEK medium uten penicillin og streptomycin. </li><li> Pipette kombinert løsninger AB (kalsiumfosfat bunnfall) direkte til HEK293T celler og fordele jevnt ved forsiktig rocking. </li><li> 24 timer etter transfeksjon av HEK-293T celler med lentivirus, fjern vekstmedium og erstatte den med 25 ml frisk, forvarmet HEK medium. Returnere transfekterte heks i inkubatoren. </li><li> 48 timer etter transfeksjon av HEK-293T celler med lentivirus, samle vekstmedier inneholder lentiviral partikler fra transfekterte heks. Fjerne partikler rusk fra høstet viral løsningen ved sentrifugering ved 3000 xg i 5 min ved 4 ° C. </li><li> Konsentrere virus ved ultrasentrifugering through en 20% sukrose pute (2 ml sucrose/25 ml viral supernatant) i 2 timer ved 112.000 xg ved 4 ° C. Suspendere viral pellet i 0,4 ml MEF medium ved 4 ° C i 15-30 min med forsiktig vuggende. Oppbevar viruspartikler i engangsbruk alikvoter (dvs. 50 ul) ved -80 ° C. </li></ol> 2. Utarbeidelse av mus embryonale fibroblaster (MEF) for omprogrammering Merk: Protokollen skissert her gjelder avledning av iPSCs fra E 13,5 mus embryonale fibroblaster for bruk i TEC-analyser. Mens andre grupper har generert all-IPSC mus fra voksne donorcellen kilder, har vi ikke testet denne metoden på andre celletyper og kan ikke være sikker på at donor celletype er ikke en faktor. <ol><li> Sett opp mus tidsinnstilte parringer. På embryonale dag 13,5 (E13.5), avlive den gravide kvinne og dissekere embryoene fra livmor horn. Sted og lagre befruktede egg i 1x PBS (pre-kjølt til 4 ° C) på is. </li><li> Fjern de extraembryonic vev (dvs.chorion, amnion og morkake). Halshogge fosteret, og fjern deretter (valgfritt - om nødvendig for genotyping) og lemmer. Scoop ut indre organer, ved hjelp av pinsett eller en scoop formet slikkepott og hakke den gjenværende kadaveret med bladet på en skalpell eller skarpe saks. </li><li> Vask hakket skrotten i 5 ml pre-kjølt 1x PBS. Sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter. </li><li> Aspirer supernatanten. Suspendere pelleten i 5 ml 0,25% trypsin-EDTA og inkuber ved 37 ° C med kraftig risting for 20-30 min. </li><li> Tilsett 5 ml av MEF medium (forvarmet til 37 ° C), bland og sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter. </li><li> Aspirer supernatant og resuspender pellet i forvarmet MEF medium. </li><li> Plate dissosiert MEFs på 2-3 brønner på et 6-brønns plate før belagt med 0,1% gelatin. Dette regnes passasje 1. </li><li> Passage MEFs ved en fortynning på 1:04-1:05 hver 48 hr. MEFs på passasje 3 er klar for lentiviral transduksjon. </li></ol> 3. Avledning av IPSC Lines <ol><li> Dagen før lentiviral transduksjon; frø ~ 3 x 10 5 primær MEFs inn en brønn i en 6-brønns plate før belagt med 0,1% gelatin. </li><li> Dag 1: Primær MEFs bør være 80-90% confluent for lentiviral transduksjon. Legg lentiviral partikler direkte til MEF medier og inkuber med MEFs natten ved 37 ° C, 5% CO 2 i en fuktet miljø. </li><li> Den følgende dag (dag 2) Aspirer mediet og vask to ganger med 3 ml 1x PBS for å fjerne virale partikler. </li><li> Tilsett 0,5 ml forvarmet 0,25% Trypsin-EDTA til cellene og inkuber ved 37 ° C i 3-5 min med sporadisk gynge. </li><li> Triturate å oppnå en enkelt-cellesuspensjon. Observere cellene ved lysmikroskopi for å sikre en enkel cellesuspensjon. </li><li> Overfør MEFs inn et 15 ml konisk rør inneholdende 5 ml MEF medier. Sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten og forsiktig Resuspender celler i MEF medium. </li><li> Jevnt delt cellesuspensjonen mellom to brønner i en 6 brønn Psen pre-belagt med 0,1% gelatin. </li><li> Rock platen frem og tilbake, side til side, og en gang i en sirkulær bevegelse for å oppnå en jevn fordeling av celler i hele brønnen. Inkuber over natten ved 37 ° C, 5% CO 2 i en fuktet miljø. </li><li> Dag 3: Gjenta trinn 4-9 bortsett splitte cellene jevnt fra én brønn til 3 brønner i en 6 brønners plate pre-belagt med 0,1% gelatin. Dette vil gi 6 brønner av transduced primære fibroblaster. </li><li> Dag 4: Legg doksycyklin (DOX) ved en konsentrasjon på 10 ug / ml til 5/6 brønner. En brønn bør forbli ubehandlet for å tjene som en kontroll. </li><li> Legg VPA på 1,9 mM til 3 av de 5 brønner behandlet med DOX. VPA reduserer formeringshastigheten av MEFs. Tett kulturer av MEFs tolerere langvarig eksponering for VPA mens subconfluent kulturer har en tendens til å senesce innen 2-5 dager. Derfor bør MEFs være 100% confluent når VPA tilsettes. Merk: Vi bruker VPA i våre omprogrammeringskostnader forsøk fordi det er et kjent epigenetic modifier, og har vært shegne for å effektivisere IPSC generasjon 17 selv om effekter og mekanismer VPA handling med hensyn til å generere fullt pluripotente IPSC linjer ikke er kjent. </li><li> Dag 5: Aspirer medium, vask og trypsinize cellene som før. Passage cellene behandlet med DOX / VPA til en 15 cm to vevskultur parabolen pre-belagt med 0,1% gelatin og hver av de andre betingelser for å forbelagte 10 cm 2 retter i ES celle medium supplert med fersk DOX og VPA. </li><li> Fylle celler hver dag med ESC medium supplert med frisk DOX og VPA. ESC-lignende kolonier bør begynne å vises etter ~ 7 dager i DOX / VPA behandling og etter ~ 10 dager i DOX alene behandling. Ingen kolonier skal vises i fravær av DOX behandling. </li><li> Gang kolonier besitter en lys refraktiv, veldefinerte kant og inneholder 30-50 celler, manuelt isolere kolonier med en gel lasting pipettespiss og overføring til en U-bunn 96 brønns plate inneholdende 20 pl av 00,25% trypsin-EDTA. Trypsinize til enkeltceller og overføre til feeders i en flat bunn plate med 96 brønner i 150 ul ESC medium som inneholder DOX / VPA eller DOX alene. </li><li> Fortsett å klonalt utvide isolerte IPSC linjer på feeders i ESC medium. Fjern DOX og VPA på dag 19 etter deres tillegg (post-transduksjon dag 23). Kast IPSC linjer som ikke opprettholder selvfornyelse eller spredning priser ligner MGP kontroller. </li></ol> Det kan være nyttig å karakterisere dine IPSC linjer i forhold til ESCs før du prøver å utføre TEC. Vi har karakterisert våre linjer ved å 1) uttrykk for endogene pluripotency markører (SSEA-1, Oct4, Sox2, Nanog) ved immunocytokjemi, 2) karyotype analyse av kromosom telling og 3) embryoid kroppen formasjon. Man kan også utføre lentiviral-spesifikke RT-qPCR for å bekrefte at proviral transgener ikke uttrykkes i iPSCs. Imidlertid har vi identifisert fullt pluripotent iPSCs med bare morfologi, farging og karyotyping. I våre eksperimenter, valg av IPSC linjer basert på ESC-lignende morfologi og vekst egenskaper resultater i de fleste linjene uttrykker pluripotency markører mens vi vanligvis identifisere flere linjer med potensielt unormale Karyotyper. 4. Utarbeidelse av iPSCs for Blastocystinnsetting Injection Passasje antall en PSC linje har blitt vist å påvirke sin pluripotency 18 selv om dette kan være linje avhengig 19. Vi har brukt iPSCs av fra passasjer 8-14 til produsere voksen all-IPSC mus. <ol><li> Tine iPSCs og plate på feeders i ESC medium. Passasje cellene minst én gang på feeders før bruk for injeksjon. </li><li> Én brønn av en 6-brønns plate som inneholder 70-80% konfluente iPSCs vil gi mer enn en tilstrekkelig antall celler for injeksjon. Aspirer dyrkningsmedium og vask cellene med ~ 3 ml 1x PBS (uten Ca 2 + / Mg 2 +). </li><li> Tilsett 0,5 ml forvarmet 0,05% Trypsin-EDTA tilcellene og inkuber ved 37 ° C i 10 min med sporadisk gynge. </li><li> Triturate å oppnå en enkelt-cellesuspensjon. Observere cellene ved lysmikroskopi for å sikre en enkel cellesuspensjon. De iPSCs trenger å være i enkel cellesuspensjon som kolonier / celleaggregatene vil tette injeksjonen pipetten. </li><li> Når en enkel cellesuspensjon har ben oppnådd, tilsett 1,0 ml ESC media til brønnen og returnere platen til 37 ° C inkubator. Inkuber i ~ 15 minutter, eller til de fleste forer har begynt å følge. </li><li> Fjern forsiktig mediet som inneholder iPSCs ta vare ikke å løsne de svakt klebrige feeders. </li><li> Plasser iPSCs i et 15 ml konisk rør inneholdende 5 ml ESC medium. Sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten og fjerne resten av ES cellen medium med en mikropipette. Pek på røret for å løsne pellet og forsiktig resuspender celler i 0,2 til 0,5 ml ferdigfylt kjølt FHM medium. Lagre celler på is inntil og under injeksjon i tetraploid blastocysts. </li></ol> 5. Generasjon av tetraploid Blastocysts Prosedyrer utført i denne seksjonen er blitt beskrevet i detalj et annet sted 5,6,20. Her skisserer vi vår teknikk, optimalisert for BTX Electro Cell manipulator ECM 2001. <ol><li> Sett opp embryo donor mus ved priming 23-28 dager gamle hunnmus (C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1) med PMS og HCG. Administrer 5 IE PMS på 14:00 og 5 IE HCG 47 timer senere. Etter HCG injeksjon, sette opp hunnmus med C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1 stud menn. Sjekk følgende dag for vaginal plugger. </li><li> Avlive plugget hunnmus og samle egglederne. Samle en celle embryoer ved å plassere egglederne i FHM med Hyaluronidase og forsiktig rive ampulae. Tillat Cumulus massene til å sitte i FHM / Hyaluronidase for 5-7 min. </li><li> Samle en celle embryo ved hjelp av en munn pipette og vask gjennom dråper FHM media før du legger dem i KSOM-AA kultur. Kultur ved 37 ° C, 5% CO 2 under mineralolje over natten og velge 2-celle embryoer dagen elektrosveising, forkaste alle andre embryoer. </li><li> Plasser en BTX Microslide i en 10 cm petriskål. Helle nok romtempererte elektrosveising media til senk lysbildet i løsningen, men ikke så mye at polene på elektroden er helt under vann. </li><li> Slå på ECM 2001 og BTX Enhancer 400. Koble ECM er kabler til microslide er elektroden og fikse kablene til siden av petriskål å hindre utilsiktet bevegelse av lysbildet. </li><li> Kjør et manuelt puls for å få en lesning på BTX enhancer og noter spenning AC / DC strøm blir brukt. Vekselstrøm vil styre hastigheten som embryoene vil justere mellom elektrodene, vil likestrøm sikring av blastomeres og puls tid vil stille inn lengden av DC puls. Et godt utgangspunkt er AC 3V, DC 100V, og tid 0.05 msek. Den optimale DC varierer i området av 90-150 volt. </li&gt; <li> Ved hjelp av en munn pipette, ta ca 30-40 to-celle embryo fra KSOM-AA kultur og vaske dem gjennom flere dråper elektrosveising medium. Tegn ferske Electrofusion media fra microslide parabolen i munnen pipette og ta embryoer fra vask. Plasser dem i 1 mm gap mellom elektrodene på microslide. Vær forsiktig at de er justert ned midten av gapet, og at de ikke er i kontakt med hverandre. </li><li> Påfør vekselstrøm ved å trykke på manuell puls-knappen. Embryoene roterer i AC-feltet, inntil planet for blastomere kontakt er parallell til elektrodene. Hvis embryoer ikke er justert i et par sekunder, øker AC innstilling. </li><li> Etter embryo har justert, trykk på manuell puls-knappen igjen for å bruke DC puls. </li><li> Med elektrosveising medium i pipetten, samle embryoene fra microslide. Vask embryoer gjennom flere dråper KSOM-AA og plassere dem i KSOM-AA kultur ved 37 ° C, 5% CO 2. Den blastomere fusion shoULD være ferdig på mindre enn 30 minutter i kultur. </li><li> Gjenta trinn 7-11 for resterende 2-cellers embryo. Etter påfølgende fusjon grupper, overvåke og velg embryoer med smeltet blastomeres. Vellykket kondenserte embryo vil synes å være i en-celle stadiet. Kast lysert og 2-celle embryoer etter 30 min i kultur. Hvis fusion rate er under 80%, øke spenningen og / eller tid i trinn på 5V og 0,01 millisekunder. Hvis lysis er over 20%, redusere DC spenning og / eller tid deretter. Optimale innstillinger i våre eksperimenter var AC 4V, DC 146V, og 0,07 millisekunder. Disse innstillingene konsekvent gitt 90% eller høyere fusion priser med liten eller ingen lysis. </li><li> Fortsett til kultur smeltet embryoer i microdrops av KSOM-AA henhold mineralolje ved 37 ° C, 5% CO 2. Du bør forvente 85-95% av smeltet embryoer for å danne tetraploide (4N) blastocysts etter 48 timer inkubasjon. </li></ol> 6. Mikroinjeksjon av iPSCs inn tetraploid Blastocysts Vi bruker et Nikon TE-2000Uinvertert mikroskop utstyrt med DIC optikk og Narishige mikromanipulator for blastocyst injeksjon. Hver tetraploid blastocyst injiseres med 10-12 iPSCs ved hjelp av en standard protokoll for ESC injeksjon i mus blastocysts som har blitt vist i en tidligere Jove publikasjon 5,20,21 <ol><li> Plasser en 20 pl dråpe FHM i sentrum av en konkav objektglass og dekke den med 150 pl mineralolje. </li><li> Senk holder pipetten og mikroinjeksjon nål inn i FHM slipp. Tillat 2-3 min for begge nåler til delvis fylles med FHM. </li><li> Vask 20-30 tetraploide blastocysts gjennom dråper FHM og overføring til FHM slipp på objektglass. </li><li> Munn pipette IPSC blandingen i fallet. Det kan være nødvendig å fortynne celleblanding i en dråpe FHM forhånd hvis celler for konsentrert eller aggregeres. </li><li> Plukk opp 100-200 celler med nålen. </li><li> Hold blastocyst med den indre cellemasse i ni position. Injisere cellene i blastocoel ved å trenge inn i zona pellucida og trophoblast på tre posisjon. Injisere 16-18 celler per blastocyst. </li><li> Returnere IPSC suppleres blastocysts til KSOM-AA kultur. </li></ol> 7. Overføring av suppleres tetraploid Blastocysts i livmor Horns Mottakerens Mus Suppleres tetraploide blastocysts er kirurgisk overført til livmor horn av kvinnelige mottaker mus i henhold til retningslinjene fra forskerens instituttet, ved hjelp av standard teknikk 20 som vi skal kort oppsummere. Velg kvinnelige CD-en mus på pro-estrus scenen og sette dem opp for parring med vasectomized hanner. Sjekk for vaginal plugger neste morgen. Kvinner er klare for livmor embryo to dager etter pluggen ble oppdaget (2,5 DPC). En dag før mottaker kvinner er parret med vasectomized menn, satt opp flere CD-en kvinner med ikke-vasectomized mennskal brukes som fosterhjem mødre for all-IPSC mus hentet ved keisersnitt. 8. Keisersnitt og ivaretakelse av IPSC-avledet Pups Overføring av TC embryo vanligvis resulterer i flere resorpsjoner etter implantering, selv om IPSC eller ESC Line har en høy utviklings potensial. Som et resultat, kan man forvente høyst 4 levedyktige valper (vanligvis 1-2) pr mottaker. Disse små kull er vanligvis neglisjert av mottakerne. Å øke nivået av neonatal omsorg og overlevelse, utfører vi keisersnitt og fremme henhold til standard protokoller 20. Å utføre keisersnitt, avlive mottaker mus 16 dager etter embryo ved 7-20:00 (mottaker 18,5 DPS) og dissekere valper fra livmor horn. Foster levedyktige unger til CD-en mødre som leverte kull samme dag.

<ol>
	<li>Boland, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mice+generated+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Adult mice generated from induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 461, 91-94 (2009).</li><li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy.">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6209-6214 (2001).</li><li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Generation of embryonic stem (ES) cell-derived embryos and mice by tetraploid-embryo complementation. , (2006).</li><li>McLaughlin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+tetraploid+embryos+by+electrofusion.">Production of tetraploid embryos by electrofusion.</a> Methods Enzymol. 225, 919-930 (1993).</li><li>Humpherys, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+instability+in+ES+cells+and+cloned+mice.">Epigenetic instability in ES cells and cloned mice.</a> Science. 293, 95-97 (2001).</li><li>Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z., Gao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells+can+support+full-term+development+of+tetraploid+blastocyst-complemented+embryos.">iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos.</a> Cell Stem Cell. 5 (09), 135-138 (2009).</li><li>Zhao, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells+produce+viable+mice+through+tetraploid+complementation.">iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation.</a> Nature. 461, 86-90 (2009).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+mice+produced+from+three-factor+induced+pluripotent+stem+(iPS)+cells+through+tetraploid+complementation.">Viable mice produced from three-factor induced pluripotent stem (iPS) cells through tetraploid complementation.</a> Cell Res. 21, 546-549 (2011).</li><li>Zhao, X. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+Fertile+Mice+Generated+from+Fully+Pluripotent+iPS+Cells+Derived+from+Adult+Somatic+Cells.">Viable Fertile Mice Generated from Fully Pluripotent iPS Cells Derived from Adult Somatic Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6, 390-397 (2010).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx3+improves+the+germ-line+competency+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Tbx3 improves the germ-line competency of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 463, 1096-1100 (2010).</li><li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+prevents+loss+of+Dlk1-Dio3+imprinting+and+facilitates+generation+of+all-iPS+cell+mice+from+terminally+differentiated+B+cells.">Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells.</a> Nat. Genet. 44, 398-405 (2012).</li><li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+silencing+of+imprinted+genes+on+chromosome+12qF1+in+mouse+induced+pluripotent+stem+cells.">Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 465, 175-181 (2010).</li><li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li><li>Go, W. Y., Ho, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+direct+comparison+of+the+dimerizer+and+reverse+tet+transcriptional+control+systems.">Optimization and direct comparison of the dimerizer and reverse tet transcriptional control systems.</a> The Journal of Gene Medicine. 4, 258-270 (2002).</li><li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds.">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nature. 26, 795-797 (2008).</li><li>Li, X. -. y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation.">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell and Tissue Research. 327, 607-614 (2007).</li><li>George, S. H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+adult+phenotyping+directly+from+mutant+embryonic+stem+cells.">Developmental and adult phenotyping directly from mutant embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 4455-4460 (2007).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2003).</li><li>Kirak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnuclear+Mice+with+Pre-defined+T+Cell+Receptor+Specificities+Against+Toxoplasma+gondii+Obtained+Via+SCNT.">Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT.</a> J. Vis. Exp. (43), e2168 (2010).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Generere mus fra IPSC linjer ved hjelp av TEC-analyser gir en streng funksjonell test for pluripotency av en IPSC linje. Denne testen kan være nyttig for å vurdere den relative effekten av ulike omprogrammeringskostnader metoder eller for å identifisere IPSC linjer som kan være mest nyttig for å generere visse celletyper in vitro. Mus som genereres fra iPSCs kan brukes til strengt teste den langsiktige stabilitet og tumorigenitet av IPSC-deriverte vev. Denne protokollen vil være nyttig for etterforskerne ønsker å generere fullt pluripotente IPSC linjer eller IPSC mus eller for å sammenligne den relative nytten av ulike omprogrammeringskostnader metoder. Mekanismene som styrer produksjon og identifisering av fullt pluripotent iPSCs forbli dårlig forstått, og det er mulig at noen IPSC linjer produsert ved hjelp av denne metoden vil ikke bestå TEC test. Mange faktorer kan variere mellom eksperimenter inkludert genetiske bakgrunn, lentiviral titer, mønstre av lentiviral insertion, cellesyklus parametere i donorpopulasjon, til inter-laboratoriet forskjeller i ulike trinn i TEC prosedyren og variable tilbøyeligheter av iPSCs havnen genetiske eller epigenetic avvik. Til beste sikre suksess, vi tar vare å etablere hensiktsmessige nivåer av lentiviral genuttrykk i IPSC derivasjon eksperimenter ved å teste viral fortynninger om kontroll MEFs å sikre at hver viruset er tilstrekkelig konsentrert til å gi målbare genuttrykk minst 80% og ideelt 100% av MEFs. Dette gir oss muligheten til å identifisere linjer med flere kopier av ulike lentiviruses samtidig som den begrenser toksisitet for MEFs og produsere kolonier uten overbefolkning brønnene. Det bør bemerkes at flere andre protokoller har vist seg å produsere iPSCs med full utvikling potensial, bruker flere metoder og donorcellen kilder tyder på at flere baner til full pluripotency kan eksistere 1,8-13,15. I dag, derimot, ingen definitive biomarkør av fullt pluripotent IPSChar blitt identifisert og derfor TEC analysen fortsatt gullstandarden test av om en IPSC linje kan generere alle celle linjene i en organisme.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES cell qualified FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>104392-024</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-071</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma M7522</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES006-B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11150-059</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO (murine LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4543</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040-133</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin, for superovulation, freeze-dried, 2,000 IU</td>
			<td>Harbor-UCLA Research Institute</td>
			<td>n/a</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chorionic gonadotropin, human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHM medium with Hyaluronidase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-056-F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM-1/2 AA medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-106-D</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHM</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-024-D</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, for embryo transfer, embryo tested</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, embryo tested</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5310</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), embryo tested</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic fibroblasts, non-irradiated</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PMEF-CFL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>
			Media and buffers used in this protocol
			HEK293T growth medium. 90% DMEM, 10% FBS, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. Exclude penicillin and streptomycin from HEK media used on day of transfection. HEK medium can be stored at 4 &deg;C for up to 1 month.
			2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM Na2HPO4&middot;7H2O, 12 mM Dextrose. pH to 7.1 +/- 0.1. pH is critical! Sterile filter and store at 4 &deg;C.
			Mouse embryonic fibroblast (MEF) growth medium (also for use with feeders). 70% DMEM, 20% Medium 199, 10% FBS, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. Store at 4 &deg;C for up to 1 month.
			ESC growth medium. 85% DMEM,15% ES cell qualified FBS, 1x Glutamax, 0.1 mM non-essential amino acids, 0.1 mM &beta;-mercaptoethanol, 1,000 U/ml ESGRO, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. ESC media can be stored at 4 &deg;C for up to three weeks.
			Electrofusion medium. 0.3 M Mannitol, 0.1 mM MgSO4, 50 mM CaCl2, and 3% BSA in embryo tested water. Store at 4 &deg;C for up to 3 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of mice derived from induced pluripotent stem cells

Produksjonen av induserte pluripotente stamceller (iPSCs) fra somatiske celler gir et middel for å skape verdifulle verktøy for grunnforskning og kan også gi en kilde til pasient-matchet celler for regenerativ behandling. iPSCs kan genereres ved hjelp av flere protokoller og stammer fra flere celle kilder. Når generert, er iPSCs testet ved hjelp av en rekke tester, inkludert farging for pluripotency markører, generasjon av tre bakterie lag i embryoid organer og teratomer, sammenligninger av genuttrykk med embryonale stamceller (ESCs) og produksjon av kimære mus med eller uten germline bidrag 2 . Viktigere, IPSC linjer som passerer disse testene fortsatt varierer i deres evne til å produsere ulike differensierte celletyper 2. Dette har gjort det vanskelig å finne ut hvilke IPSC derivasjon protokoller, donorcellen kilder eller valg metoder er mest nyttige for ulike bruksområder. De strengeste testom en stamcelle linje har tilstrekkelig utviklingsmessige potensiale til å generere alle vev som kreves for å overleve i en organisme (kalt fulle pluripotency) er tetraploid embryo complementation (TEC) 3-5. Teknisk, innebærer TEC elektrosveising av to-cellers embryo for å generere tetraploide (4N) one-celle embryo som kan dyrkes in vitro til blastocyst stadiet 6. Diploide (2n) pluripotent stamceller (f.eks ESCs eller iPSCs) blir deretter injisert i blastocoel hulrommet i tetraploid blastocysten og overført til en mottaker kvinnelig for svangerskap (se figur 1). Den tetraploid komponenten av supplert embryoet bidrar nesten utelukkende til extraembryonic vev (placenta, plommesekken), mens de diploide celler utgjør fosteret riktig, noe som resulterer i et foster avledet helt fra injisert stilk cellelinje. Nylig rapporterte vi avledning av IPSC linjer som reproduserbart generere voksne musvia TEC en. Disse IPSC linjer gir opphav til levedyktige unger med virkningsgrad på 5-13%, noe som er sammenlignbart med ESCs 3,4,7 og høyere enn det som er rapportert for de fleste andre IPSC linjer 8-12. Disse rapportene viser at direkte omprogrammering kan produsere fullt pluripotent iPSCs som samsvarer ESCs i deres utviklingsmessige potensialet og effektivitet for å generere unger i TEC tester. I dag er det ikke klart hva som skiller mellom helt pluripotent iPSCs og mindre potente linjer 13-15. Det er heller ikke klart hvilke omprogrammering metoder vil produsere disse linjene med høyest mulig effektivitet. Her beskriver vi en metode som gir fullt pluripotent iPSCs og &quot;all-IPSC&quot; mus, som kan være nyttig for etterforskerne ønsker å sammenligne pluripotency av IPSC linjer eller etablere likeverdighet ulike omprogrammeringskostnader metoder.

In step 3, "Derivation of iPSCs from MEFs", one should observe morphological heterogeneity and immature iPSC colony formation starting 4-5 days after doxycycline/VPA addition and mature colonies between 7-10 days (Figure 2). The production of one-cell tetraploid embryos in step 5 is highly efficient (Figure 3). We routinely observe up to 95% of treated two-cell embryos successfully fuse to produce tetraploid one-cell embryos. The protocol followed to inject iPSCs into tetraploid blastocysts (Step 6, Figure 4) is similar to the protocol for injection of ESCs into diploid blastocysts to generate chimeric mice, and can be performed by an experienced microinjectionist. The number of live pups born depends on the cell line (Table 1).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">MEF preprogramming efficiency 0.01-0.03%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">Efficiency of iPSC mouse production by TEC</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>Name</td>
			<td>Description</td>
			<td>Blastocysts injected</td>
			<td>Live Newborn</td>
			<td>Live Adult</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-21</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>867</td>
			<td>53 (6.1%)</td>
			<td>19 (2.2%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-9</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>195</td>
			<td>7 (3.6%)</td>
			<td>4 (2.1%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-11</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>338</td>
			<td>1(0.3%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Representative Results.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1.jpg" /> 
Figure 1. Schematic of experimental design. Top left: Production of tetraploid blastocysts. Fertilized two-cell embryos from albino mice are electrofused to generate tetraploid one-cell embryos, which are cultured in vitro to the blastocyst stage. Bottom left: Reprogramming. Mouse embryonic fibroblasts are transduced with lentiviral particles encoding Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc and the reverse tetracycline transactivating protein, rtTAM2.2. Addition of doxycycline results in transgene expression and the initiation of reprogramming to iPSCs. Right: Production of iPSC mice. iPSCs derived from pigmented mice are injected into the blastocoel of tetraploid blastocysts and then surgically implanted into pseudo-pregnant recipient mice. Newborn iPSC mice are delivered by Caesarian section and cross-fostered. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig1large.jpg" target="_blank"> Click here to view larger figure</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2.jpg" /> 
Figure 2. Morphological changes associated with reprogramming. From left to right: Examples of the morphological progression from fibroblasts to iPSC colonies during the course of a reprogramming experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig2large.jpg" target="_blank"> Click here to view larger figure</a>.
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig3.jpg" /> 
Figure 3. Production of tetraploid embryos. Diploid two-cell embryos are subjected to an electric pulse resulting in blastomere fusion and generation of one-cell tetraploid embryos.
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig4.jpg" /> 
Figure 4. Production of iPSC mice. Left: iPSCs are injected into the blastocoel of a tetraploid blastocyst. Middle: Newborn iPSC mice are distinguished by pigmented eyes. Right: iPSC mouse at three weeks post-delivery.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generere indusert pluripotent stamceller (IPSC) linjer produserer linjer med ulik utvikling potensial, selv når de passerer standard tester for pluripotency. Her beskriver vi en protokoll for å produsere mus avledet helt fra iPSCs, som definerer IPSC linjer som innehar fulle pluripotency<sup&gt; 1</sup&gt;.

Generasjon Mus Utledet fra Utførte pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Velge og isolere kolonier av menneskeskapte pluripotent stamceller omprogrammert fra voksne Fibroblaster

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering Menneskelige Somatiske celler i Utførte pluripotent stamceller (iPSCs) Bruke retrovirale Vector med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Generasjon av menneskeskapte pluripotente stamceller fra perifert blod Bruke STEMCCA lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Rask og effektiv produksjon av nerveceller fra menneskelige pluripotente stamceller i en Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: En Differensiering Protokoll fra mater-frie menneskeskapte pluripotent stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelig indusert pluripotent stamceller fra menneskelige somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...