Name: generation of mice derived from induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2012-11-29T12:00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Stöd till KKB var MJB, JLH och KLN från California Institute för regenerativ medicin, Pew Charitable Trusts Biomedicinsk Scholars Program, Esther B. O&#39;Keeffe Family Foundation och Shapiro Family Foundation. KKB är en Donald E. och Delia B. Baxter Foundation fakulteten Scholar.

Denna metod användes i forskningen rapporterades i Boland et al. Nature. 461, 91-96 (2009). 1 1. Framställning av Lentivirus Detta protokoll använder doxycyklin-inducerbara lentivirala skyttelvektorer som kodar för Oct4, Sox2, Klf4, och c-Myc under kontroll av en tetO svarselement. Transgener aktiveras av den omvända tetracyklin trans-aktiverande protein, rtTAM2.2 16, vilket inducerar omprogrammering faktor expression i närvaro av doxycyklin. Detta system möjliggör hårt kontrollerad, högt uttryck av omprogrammering faktorer. De lentivirala vektorer som används här är själv-inaktiverande och därmed inte kan replikera följande genomisk integration. Men krävs försiktighet vid arbete med lentivirus och bör utföras i laboratorier uppfyller BSL2 (USA) och S2 (Europa) normer. <ol><li> Tina HEK293T celler och passage minst en gång innan transfection. Cellerna bör hållas vid subkonfluent densitet i HEK-medium vid 37 ° C, 5% CO 2 i en fuktad miljö. Rutinmässigt passage celler var 2 dagar med en delad förhållande 1:06 till 01:10. </li><li> Seed ~ 8 x 10 6 HEK293T cells/T150 med 25 ml HEK medium. Använd en T150 för varje lentivirus preparat. </li><li> Följande dag transfektera HEK293T-celler genom kalciumfosfatutfällning. (Obs! i våra händer kalciumfosfatutfällning rutinmässigt ger 80-90% transfektionseffektivitet, men kan katjoniska lipid transfektion reagens såsom Lipofectamine 2000 också användas). Förbered två 15 ml koniska rör för varje virus att vara förberedd. Märk rören &quot;A&quot; och &quot;B&quot;. Rör A, 10 ^ g av var och en av: de lentivirala skyttelvektor kodar omprogrammering faktorer (eller rtTAM2.2), de virala vektorerna förpackningar, och plasmid som kodar för virala höljesproteinet, VSVG. Lägg 186 ul 2 M CaCl 2 i rör A och föra volymen till 1,5 ml med sterilt H 2 O. Rör B: 1,5 ml 2X HBS (förvärmd till rumstemperatur). </li><li> Pipettera blandningen i röret A tills den är en homogen lösning. Lägg lösning A till lösning B droppvis och låt stå vid rumstemperatur under 2-3 min. </li><li> Aspirera tillväxtmedium HEK293T celler och ersätta med 22 ml förvärmd HEK-medium utan penicillin och streptomycin. </li><li> Pipettera kombinerade lösningarna AB (kalciumfosfat fällning) direkt till HEK293T celler och fördela jämnt genom försiktig skakning. </li><li> 24 timmar efter transfektion av HEK-293T-celler med lentivirus, avlägsna tillväxtmedium och ersätta den med 25 ml färskt, förvärmd HEK-medium. Återgå transfekterade Heks till inkubatorn. </li><li> 48 timmar efter transfektion av HEK-293T-celler med lentivirus, samla odlingsmedia innehållande lentivirala partiklar från de transfekterade Heks. Avlägsna partikelformigt skräp från den skördade virala lösningen genom centrifugering vid 3.000 x g under 5 min vid 4 ° C. </li><li> Koncentrera viruset genom ultracentrifugering through en 20% sackaroskudde (2 ml sucrose/25 ml viral supematant) under 2 h vid 112.000 xg vid 4 ° C. Suspendera virala pelleten i 0,4 ml MEF-medium vid 4 ° C under 15-30 minuter med försiktig skakning. Förvara virala partiklar i engångsbruk alikvoter (dvs. 50 | il) vid -80 ° C. </li></ol> 2. Beredning av Mouse Embryonala fibroblaster (MEF) för omprogrammering Obs: det protokoll som beskrivs här avser att härleda iPSCs från E 13,5 mus embryonala fibroblaster för användning i TEC-analyser. Även andra grupper har genererat helt IPSC möss från vuxna källor givarcell har vi inte testat metoden på andra celltyper och kan inte vara säker på att givare celltyp är inte en faktor. <ol><li> Ställ in mus tidsinställda parningar. På embryonal dag 13,5 (E13.5), avliva den dräktiga honan och dissekera embryon från livmoderhornen. Plats och embryon lagra i 1x PBS (före kyld till 4 ° C) på is. </li><li> Ta bort extraembryonic vävnader (dvs.korion, amnion och moderkakan). Halshugga embryot och ta bort svansen (tillval - om det behövs för genotypning) och lemmar. Gröp ur inre organ, med hjälp av pincett eller en skopa formad spatel och finhacka resten stomme med bladet av en skalpell eller vass sax. </li><li> Tvätta det malda stommen i 5 ml i förväg kyld 1x PBS. Centrifugera vid 200 x g under 5 minuter. </li><li> Aspirera supernatanten. Suspendera pelleten i 5 ml 0,25% trypsin-EDTA och inkubera vid 37 ° C under kraftig skakning under 20-30 min. </li><li> Tillsätt 5 ml av MEF-medium (förvärmd till 37 ° C), blanda och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter. </li><li> Sug supernatanten och återsuspendera pelleten i förvärmd MEF medium. </li><li> Platta dissocierat MEF i 2-3 brunnar av en 6-brunnsplatta förbelagd med 0,1% gelatin. Detta anses passagen 1. </li><li> Passage MEF vid en utspädning av 1:04 till 1:05 var 48 timmar. MEF vid passage 3 är redo för Lentiviral transduktion. </li></ol> 3. Härledning av IPSC Lines <ol><li> Dagen före transduktion Lentiviral, utsäde ~ 3 x 10 5 primär MEF i en brunn i en 6-brunnsplatta förbelagd med 0,1% gelatin. </li><li> Dag 1: Primär MEF ska vara 80-90% konfluenta för Lentiviral transduktion. Lägg lentivirala partiklar direkt till MEF media och inkubera med MEF natten vid 37 ° C, 5% CO 2 i en fuktad miljö. </li><li> Följande dag (dag 2) aspirera mediet och tvätta två gånger med 3 ml 1 x PBS för att avlägsna viruspartiklar. </li><li> Tillsätt 0,5 ml förvärmd 0,25% trypsin-EDTA till cellerna och inkuberas vid 37 ° C under 3-5 minuter med sporadisk skakning. </li><li> Finfördela att uppnå en enkel-cellsuspension. Observera celler med Ijusmikroskopi för att säkerställa en enkelcellsuspension. </li><li> Överför MEF i ett 15 ml koniskt rör innehållande 5 ml medium MEF. Centrifugera vid 200 x g under 5 minuter. Aspirera supernatanten och försiktigt återsuspendera celler i MEF-medium. </li><li> Jämnt fördelade cellsuspensionen mellan två brunnar av en 6 väl psen förbelagd med 0,1% gelatin. </li><li> Rock plattan fram och tillbaka, från sida till sida, och en gång i en cirkulär rörelse för att uppnå en jämn fördelning av celler genom hela brunnen. Inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO 2 i en fuktad miljö. </li><li> Dag 3: Upprepa steg 4-9 med undantag dela cellerna jämnt från en brunn till 3 brunnar i en 6-brunnsplatta förbelagd med 0,1% gelatin. Detta kommer att ge 6 brunnar av transducerade primära fibroblaster. </li><li> Dag 4: Lägg doxycyklin (DOX) vid en koncentration av 10 pg / ml till 5/6 brunnar. En brunn bör förbli obehandlade för att tjäna som en kontroll. </li><li> Lägg VPA vid 1,9 mM till 3 av de 5 brunnarna som behandlats med DOX. VPA minskar spridningen andelen MEF. Täta kulturer av MEF tolerera långvarig exponering för VPA, medan subkonfluenta kulturer tenderar att åldras inom 2-5 dagar. Därför bör MEF vara 100% sammanflytande vid VPA tillsätts. Obs: Vi använder VPA i våra omprogrammering experiment eftersom det är ett känt epigenetisk modifierare, och har varit shegna för att öka effektiviteten i IPSC generationen 17 även om effekterna och mekanismer för VPA åtgärder med avseende på att generera fullt pluripotenta IPSC linjer inte är kända. </li><li> Dag 5: Sug mediet, tvätta och Trypsinisera cellerna som tidigare. Passage av cellerna behandlade med dox / VPA till en 15 cm 2 vävnadsodlingsskål förbelagda med 0,1% gelatin och vardera av de övriga villkoren för förbelagda 10 cm 2 rätter i ES-cell-medium kompletterat med färsk DOX och VPA. </li><li> Fyll celler varje dag med ESC-medium kompletterat med färsk DOX och VPA. ESC-liknande kolonier bör börja visas efter ~ 7 dagar i DOX / VPA behandling och efter ~ 10 dagar i DOX ensam behandling. Inga kolonier ska visas i frånvaro av DOX behandling. </li><li> När kolonier har en ljus refraktiv, väldefinierade gränsen och innehåller 30-50 celler, manuellt isolera kolonier med en gel-laddning pipettspets och överföring till en U-bottnad 96 brunnars platta innehållande 20 | il av 00,25% trypsin-EDTA. Trypsinisera till enstaka celler och överföra till matare i en flatbottnad 96 brunnsplatta i 150 ul ESC medium innehållande DOX / VPA eller DOX ensam. </li><li> Fortsätt att klonalt expandera de isolerade IPSC linjerna på matare i ESC-medium. Ta dox och VPA på dag 19 efter tillsättningen (efter transduktion dag 23). Kasta IPSC linjer som inte upprätthåller självförnyelse eller priser spridning liknar ESC kontroller. </li></ol> Det kan vara till hjälp för att karakterisera din IPSC linjer i förhållande till ekonomiska och sociala råd innan du försöker utföra EG-fördraget. Vi har karakteriserat våra linjer av 1) uttryck av endogena pluripotensbestämmande markörer (SSEA-1, Oct4, Sox2, nanog) genom immunocytokemi, 2) karyotyp analys av kromosom räkna och 3) embryoidkroppar kropp bildning. Man kan också utföra lentiviral-specifik RT-qPCR att bekräfta att de provirala transgener inte uttrycks i iPSCs. Vi har dock identifierat helt pluripotenta iPSCs med bara morfologi, immunfärgning och karyotypIng. I våra experiment, val av IPSC linjer baserat på ESC-liknande morfologi och egenskaper tillväxt resulterar i de flesta av de linjer som uttrycker pluripotensbestämmande markörer medan vi identifierar typiskt flera rader med potentiellt onormala karyotyper. 4. Beredning av iPSCs för Långtidsodling injektion Passage antal en PSC linje har visats påverka dess pluripotens 18 även om detta kan vara beroende linje 19. Vi har använt iPSCs av från passagerna 8-14 för att producera vuxna helt IPSC möss. <ol><li> Tina iPSCs och platta på matare i ESC medium. Passage cellerna minst en gång om matare före användning för injektion. </li><li> En brunn i en 6-brunnars platta innehållande 70-80% konfluenta iPSCs kommer att ge mer än ett tillräckligt antal celler för injektion. Aspirera tillväxtmedium och tvätta cellerna med ~ 3 ml 1 x PBS (utan Ca 2 + / Mg 2 +). </li><li> Tillsätt 0,5 ml förvärmd 0,05% trypsin-EDTA tillcellerna och inkubera vid 37 ° C under 10 min med tillfällig skakning. </li><li> Finfördela att uppnå en enkel-cellsuspension. Observera celler med Ijusmikroskopi för att säkerställa en enkelcellsuspension. De iPSCs måste vara i enkelcellsuspension som kolonier / cellaggregat kommer att täppa till injektionspipetten. </li><li> När en enda cellsuspension har ben uppnått, tillsätt 1,0 ml ESC media till brunnen och återföra plattan till 37 ° C inkubator. Inkubera ~ 15 min eller tills huvuddelen av matare har börjat att vidhäfta. </li><li> Ta försiktigt bort mediet innehåller iPSCs noga med att inte rubba de svagt vidhäftande matare. </li><li> Placera iPSCs i ett 15 ml koniskt rör innehållande 5 ml ESC medium. Centrifugera vid 200 x g under 5 minuter. Aspirera supernatanten och avlägsna återstoden av ES-cell-medium med en mikropipett. Tryck röret att rubba pelleten och försiktigt återsuspendera celler i 0,2-0,5 ml i förväg kyld FHM medium. Lagra celler på is tills och under injektion i tetraploida Blastocysts. </li></ol> 5. Generering av tetraploida Blastocyster Granskningsåtgärder som vidtas i detta avsnitt har beskrivits i detalj på annat håll 5,6,20. Här redogör vi för vår teknik, optimerad för BTX Electro Cell Manipulator ECM 2001. <ol><li> Ställ in möss embryo givare genom priming 23-28 dagar gamla honmöss (C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1) med PMS och HCG. Administrera 5 IE av PMS vid 14:00 och 5 IE HCG 47 timmar senare. Efter HCG injektion upprätta honmöss med C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1 stud män. Kontrollera följande dag för vaginala pluggar. </li><li> Avliva ansluten honmöss och samla äggledarna. Samla 1-cellembryon genom att placera äggledarna i FHM med hyaluronidas och försiktigt riva ampulae. Låt cumulus massorna att sitta i FHM / Hyaluronidas för 5-7 minuter. </li><li> Samla 1-cellembryon med en mun pipett och tvätta igenom droppar FHM medier innan du placerar dem i KSOM-AA kultur. Kultur vid 37 ° C, 5% CO 2 i mineralolja natten och välj 2-cellembryon dagen elektrofusion, kassera alla andra embryon. </li><li> Placera en BTX Microslide i en 10 cm petriskål. Häll tillräckligt rum medietemperatur elektrofusion att dränka bilden i lösningen, men inte så mycket att polerna av elektroden är helt under vatten. </li><li> Slå på ECM 2001 och BTX Enhancer 400. Anslut ECM: s kablar till microslide s elektroden och fäst kablarna vid sidan av petriskålen för att förhindra oavsiktlig rörelse hos bilden. </li><li> Kör en manuell puls för att få en läsning på BTX förstärkare och notera spänningen av AC / DC strömmar som tillämpas. Växelström kommer att kontrollera den hastighet med vilken embryona kommer att anpassa mellan elektroderna, kommer DC-ström smälta blastomererna, och pulstid ställer längden på DC-puls. En bra utgångspunkt är AC 3V DC 100V och tid 0,05 msek. Den optimala DC varierar i intervallet 90-150 volt. </li&gt; <li> Med hjälp av en mun pipett ca 30-40 två-cell embryon från KSOM-AA kultur och tvätta dem genom flera droppar elektrosvetsning medium. Rita färskt elektrofusion media från microslide skålen i munnen pipett och ta embryon från tvätten. Placera dem i 1 mm mellan elektroderna på microslide. Var noga med att de är inriktade i mitten av gapet och att de inte är i kontakt med varandra. </li><li> Applicera växelström genom att trycka på manuella puls-knappen. Embryona kommer att rotera i AC-fältet, till dess plan blastomeren kontakt är parallellt med elektroderna. Om embryona inte är inriktade på några sekunder, ökar AC inställning. </li><li> Efter embryon har anpassat trycker manuella puls igen för att tillämpa DC puls. </li><li> Med elektrosvetsning medium i pipetten, samla embryon från microslide. Tvätta embryon genom flera droppar KSOM-AA och placera dem i KSOM-AA kultur vid 37 ° C, 5% CO 2. Den blastomer fusion should slutföras på mindre än 30 minuter i kultur. </li><li> Upprepa steg 7-11 för kvarvarande 2-cellembryon. Efter efterföljande fusion grupper, övervaka och välj embryon med smält blastomerer. Framgångsrikt sammansmälta embryon ser ut att vara i 1-cell skede. Kasta lyserats och 2-cell embryon efter 30 min i kultur. Om fusion ligger under 80%, öka spänningen och / eller tid i steg om 5 V och 0,01 msek. Om lys är över 20%, minska likspänning och / eller tid därefter. De optimala inställningarna i våra experiment var AC 4V DC 146V och 0,07 msek. Dessa inställningar gav genomgående 90% eller högre fusion med liten eller ingen lys. </li><li> Fortsätt att kultur smält embryon mikrodroppar av KSOM-AA enligt mineralolja vid 37 ° C, 5% CO 2. Du kan förvänta dig 85-95% av smält embryon att bilda tetraploida (4n) blastocyster efter 48 timmar av inkubation. </li></ol> 6. Mikroinjektion av iPSCs till tetraploida Blastocyster Vi använder en Nikon TE-2000Uinverterat mikroskop utrustat med DIC optik och Narishige mikromanipulatorer för blastocyst injektion. Varje tetraploid blastocysten injiceras med 10-12 iPSCs med ett standardprotokoll för ESC injektion i musblastocyster som har visats i en tidigare JUPITER publikation 5,20,21 <ol><li> Placera en 20 ul droppe FHM i mitten av en konkav objektglas och täck den med 150 ul mineralolja. </li><li> Sänk innehav pipett och mikroinjektion nål i FHM droppe. Låt 2-3 minuter för båda nålar att delvis fylla med FHM. </li><li> Tvätta 20-30 tetraploida blastocyster genom droppar av FHM och överföring till FHM droppe på objektglas. </li><li> Mun pipett IPSC blandningen i nedgången. Det kan vara nödvändigt att späda cellblandningen i en droppe av FHM förväg om celler är alltför koncentrerad eller aggregeras. </li><li> Plocka upp 100-200 celler med injektionsnålen. </li><li> Håll blastocysten med den inre cellmassan i klockan 9 positjon. Injicera cellerna i blastocoel genom att penetrera zona pellucida och trofoblasten vid klockan 3. Injicera 16-18 celler per blastocyst. </li><li> Återgå IPSC kompletterade blastocyster till KSOM-AA kultur. </li></ol> 7. Överföring av kompletterade tetraploida Blastocyster i de livmoderhornen Mottagarens Möss Kompletterade tetraploida blastocyster kirurgiskt överförs till livmodern horn kvinnliga mottagare möss enligt riktlinjerna för forskarens institution, med hjälp av standardteknik 20 som vi kort sammanfatta. Välj kvinnliga CD-1-möss på pro-estrus scenen och ställa upp dem för parning med vasektomiserade hanar. Kontrollera om vaginala pluggar nästa morgon. Honorna är redo för livmodern embryo två dagar efter kontakten upptäcktes (2,5 DPC). En dag innan mottagande honor paras med vasektomiserade hanar, skapa ytterligare cd-1 honor med icke-vasektomiserade hanaratt användas som fostermödrar för all-IPSC möss hämtas genom kejsarsnitt. 8. Kejsarsnitt och främjande av IPSC-härledda Valpar Överföringen av TC embryon resulterar typiskt i multipla resorption efter implantationen, även om IPSC eller ESC linje har en hög utvecklingspotential. Som ett resultat kan man inte förvänta sig mer än 4 livskraftiga valpar (vanligtvis 1-2) per mottagare. Dessa små kullar vanligen försummas av mottagarna. För att öka graden av neonatalvård och graden av överlevnad, utför vi C-sektioner och främja enligt standarden protokoll 20. För att utföra kejsarsnitt, avliva mottagande möss 16 dagar efter embryotransfer på 7-08:00 (mottagare 18,5 DPC) och dissekera valpar från livmoderhornen. Främja hållbara valpar till CD-1 mammor som levererade kullar samma dag.

<ol>
	<li>Boland, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mice+generated+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Adult mice generated from induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 461, 91-94 (2009).</li><li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy.">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6209-6214 (2001).</li><li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Generation of embryonic stem (ES) cell-derived embryos and mice by tetraploid-embryo complementation. , (2006).</li><li>McLaughlin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+tetraploid+embryos+by+electrofusion.">Production of tetraploid embryos by electrofusion.</a> Methods Enzymol. 225, 919-930 (1993).</li><li>Humpherys, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+instability+in+ES+cells+and+cloned+mice.">Epigenetic instability in ES cells and cloned mice.</a> Science. 293, 95-97 (2001).</li><li>Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z., Gao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells+can+support+full-term+development+of+tetraploid+blastocyst-complemented+embryos.">iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos.</a> Cell Stem Cell. 5 (09), 135-138 (2009).</li><li>Zhao, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells+produce+viable+mice+through+tetraploid+complementation.">iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation.</a> Nature. 461, 86-90 (2009).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+mice+produced+from+three-factor+induced+pluripotent+stem+(iPS)+cells+through+tetraploid+complementation.">Viable mice produced from three-factor induced pluripotent stem (iPS) cells through tetraploid complementation.</a> Cell Res. 21, 546-549 (2011).</li><li>Zhao, X. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+Fertile+Mice+Generated+from+Fully+Pluripotent+iPS+Cells+Derived+from+Adult+Somatic+Cells.">Viable Fertile Mice Generated from Fully Pluripotent iPS Cells Derived from Adult Somatic Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6, 390-397 (2010).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx3+improves+the+germ-line+competency+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Tbx3 improves the germ-line competency of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 463, 1096-1100 (2010).</li><li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+prevents+loss+of+Dlk1-Dio3+imprinting+and+facilitates+generation+of+all-iPS+cell+mice+from+terminally+differentiated+B+cells.">Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells.</a> Nat. Genet. 44, 398-405 (2012).</li><li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+silencing+of+imprinted+genes+on+chromosome+12qF1+in+mouse+induced+pluripotent+stem+cells.">Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 465, 175-181 (2010).</li><li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li><li>Go, W. Y., Ho, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+direct+comparison+of+the+dimerizer+and+reverse+tet+transcriptional+control+systems.">Optimization and direct comparison of the dimerizer and reverse tet transcriptional control systems.</a> The Journal of Gene Medicine. 4, 258-270 (2002).</li><li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds.">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nature. 26, 795-797 (2008).</li><li>Li, X. -. y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation.">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell and Tissue Research. 327, 607-614 (2007).</li><li>George, S. H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+adult+phenotyping+directly+from+mutant+embryonic+stem+cells.">Developmental and adult phenotyping directly from mutant embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 4455-4460 (2007).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2003).</li><li>Kirak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnuclear+Mice+with+Pre-defined+T+Cell+Receptor+Specificities+Against+Toxoplasma+gondii+Obtained+Via+SCNT.">Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT.</a> J. Vis. Exp. (43), e2168 (2010).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Generera möss från IPSC rader med TEC-analyser ger en strikt funktionell test för pluripotens en IPSC linje. Detta test kan vara användbart för att bedöma den relativa effekten av olika omprogrammering metoder eller att identifiera IPSC linjer som kan vara mest användbar för att generera vissa celltyper in vitro. Möss genererade från iPSCs kan användas för att strikt testa den långsiktiga stabilitet och tumorigeniciteten av IPSC-härledda vävnader. Detta protokoll kommer att vara användbart för utredarna vill generera helt pluripotenta IPSC linjer eller IPSC möss eller jämföra den relativa nyttan av olika omprogrammering metoder. De mekanismer som styr generering och identifiering av fullt pluripotenta iPSCs förblir dåligt förstådd och det är möjligt att en del IPSC linjer tillverkas med denna metod inte kommer att passera med normalförbrukningsmetoden. Många faktorer kan variera mellan experiment inklusive genetiska bakgrunder, Lentiviral titer, mönster lentiviral Insertion, cellcykel parametrar givaren befolkningen, till mellan laboratorier skillnader i olika steg i normalförbrukningsmetoden och variabla benägenheter för iPSCs hysa genetiska eller epigenetiska avvikelser. För att bäst säkerställa framgång, vi tar hand att fastställa lämpliga nivåer av Lentiviral genuttryck i IPSC härledning experiment genom att testa virala utspädningar om kontroll MEF att säkerställa att varje viruset är tillräckligt koncentrerad för att producera detekterbara genuttryck åtminstone 80% och helst 100% av MEF. Detta tillåter oss att identifiera linjer med flera kopior av olika lentivirus och samtidigt begränsa toxiciteten till MEF och producera kolonier utan överbeläggning brunnarna. Det bör noteras att flera andra protokoll har visat sig ge iPSCs med full utvecklingspotential, med hjälp av flera metoder och givare källor cell tyder på att flera vägar till full pluripotens kan finnas 1,8-13,15. För närvarande är dock ingen slutgiltig biomarkör av helt pluripotenta IPSChar identifierats och därför TEC-analysen är den gyllene standarden test om en IPSC linje kan generera alla cellinjer i en organism.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES cell qualified FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>104392-024</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-071</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma M7522</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES006-B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11150-059</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO (murine LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4543</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040-133</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin, for superovulation, freeze-dried, 2,000 IU</td>
			<td>Harbor-UCLA Research Institute</td>
			<td>n/a</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chorionic gonadotropin, human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHM medium with Hyaluronidase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-056-F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM-1/2 AA medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-106-D</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHM</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-024-D</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, for embryo transfer, embryo tested</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, embryo tested</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5310</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), embryo tested</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic fibroblasts, non-irradiated</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PMEF-CFL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>
			Media and buffers used in this protocol
			HEK293T growth medium. 90% DMEM, 10% FBS, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. Exclude penicillin and streptomycin from HEK media used on day of transfection. HEK medium can be stored at 4 &deg;C for up to 1 month.
			2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM Na2HPO4&middot;7H2O, 12 mM Dextrose. pH to 7.1 +/- 0.1. pH is critical! Sterile filter and store at 4 &deg;C.
			Mouse embryonic fibroblast (MEF) growth medium (also for use with feeders). 70% DMEM, 20% Medium 199, 10% FBS, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. Store at 4 &deg;C for up to 1 month.
			ESC growth medium. 85% DMEM,15% ES cell qualified FBS, 1x Glutamax, 0.1 mM non-essential amino acids, 0.1 mM &beta;-mercaptoethanol, 1,000 U/ml ESGRO, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. ESC media can be stored at 4 &deg;C for up to three weeks.
			Electrofusion medium. 0.3 M Mannitol, 0.1 mM MgSO4, 50 mM CaCl2, and 3% BSA in embryo tested water. Store at 4 &deg;C for up to 3 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of mice derived from induced pluripotent stem cells

Produktionen av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) från somatiska celler ger en möjlighet att skapa värdefulla verktyg för grundforskning och kan även producera en källa till patient-matchade celler för regenerativa terapier. iPSCs kan genereras med hjälp av flera protokoll och härrör från flera cellkällor. När genererade är iPSCs testas med hjälp av olika analyser, inklusive immunfärgning för pluripotensbestämmande markörer, generering av tre groddblad i embryoidkroppar och teratom, jämförelser av genuttryck med embryonala stamceller (ESC) och produktion av chimära möss med eller utan könsceller bidrag 2 . Viktigt är IPSC linjer som passerar dessa tester varierar fortfarande i sin kapacitet att producera olika differentierade celltyper 2. Detta har gjort det svårt att fastställa vilka IPSC härledning protokoll, givare källor cell eller urvalsmetoder är mest användbara för olika tillämpningar. Det strängaste testetom en stamcellinje har tillräcklig utvecklingspotential för att generera alla vävnader som krävs för överlevnad av en organism (kallas helt pluripotens) är tetraploid embryo komplettering (TEC) 3-5. Tekniskt innebär TEC elektrofusion av två-cellembryon att generera tetraploida (4n) en-cellembryon som kan odlas in vitro till blastocyststadiet 6. Diploida (2n) pluripotenta stamceller (t.ex. ESC eller iPSCs) injiceras sedan in i den blastocoel hålighet tetraploid blastocysten och överfördes till en mottagare hona för dräktighet (se figur 1). Den tetraploid komponenten i kompletterade embryot bidrar nästan uteslutande till extraembryonic vävnaderna (moderkaka, gulesäcken), medan de diploida cellerna utgör embryot korrekt, vilket resulterar i ett foster som helt och hållet från den injicerade stamcellinje. Nyligen rapporterade vi härledningen av IPSC linjer som reproducerbart generera vuxna mössvia TEC 1. Dessa IPSC linjer ger upphov till livsdugliga ungar med effektiviteter av 5-13%, vilket är jämförbart med ESC 3,4,7 och högre än den som rapporterats för de flesta andra IPSC ledningar 8-12. Dessa rapporter visar att direkt omprogrammering kan producera helt pluripotenta iPSCs som matchar ekonomiska och sociala råd i deras utvecklingspotential och effektivitet att generera valpar i TEC tester. För närvarande är det inte klart vad som skiljer mellan fullt pluripotenta iPSCs och mindre potenta linjer 13-15. Det är inte heller klart vilka omfördelningar metoder ger dessa rader med högsta verkningsgrad. Här beskriver vi en metod som ger helt pluripotenta iPSCs och &quot;all-IPSC&quot; möss, som kan vara till hjälp för utredarna vill jämföra pluripotens av IPSC linjer eller fastställer likvärdigheten i olika omprogrammering metoder.

In step 3, "Derivation of iPSCs from MEFs", one should observe morphological heterogeneity and immature iPSC colony formation starting 4-5 days after doxycycline/VPA addition and mature colonies between 7-10 days (Figure 2). The production of one-cell tetraploid embryos in step 5 is highly efficient (Figure 3). We routinely observe up to 95% of treated two-cell embryos successfully fuse to produce tetraploid one-cell embryos. The protocol followed to inject iPSCs into tetraploid blastocysts (Step 6, Figure 4) is similar to the protocol for injection of ESCs into diploid blastocysts to generate chimeric mice, and can be performed by an experienced microinjectionist. The number of live pups born depends on the cell line (Table 1).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">MEF preprogramming efficiency 0.01-0.03%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">Efficiency of iPSC mouse production by TEC</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>Name</td>
			<td>Description</td>
			<td>Blastocysts injected</td>
			<td>Live Newborn</td>
			<td>Live Adult</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-21</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>867</td>
			<td>53 (6.1%)</td>
			<td>19 (2.2%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-9</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>195</td>
			<td>7 (3.6%)</td>
			<td>4 (2.1%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-11</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>338</td>
			<td>1(0.3%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Representative Results.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1.jpg" /> 
Figure 1. Schematic of experimental design. Top left: Production of tetraploid blastocysts. Fertilized two-cell embryos from albino mice are electrofused to generate tetraploid one-cell embryos, which are cultured in vitro to the blastocyst stage. Bottom left: Reprogramming. Mouse embryonic fibroblasts are transduced with lentiviral particles encoding Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc and the reverse tetracycline transactivating protein, rtTAM2.2. Addition of doxycycline results in transgene expression and the initiation of reprogramming to iPSCs. Right: Production of iPSC mice. iPSCs derived from pigmented mice are injected into the blastocoel of tetraploid blastocysts and then surgically implanted into pseudo-pregnant recipient mice. Newborn iPSC mice are delivered by Caesarian section and cross-fostered. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig1large.jpg" target="_blank"> Click here to view larger figure</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2.jpg" /> 
Figure 2. Morphological changes associated with reprogramming. From left to right: Examples of the morphological progression from fibroblasts to iPSC colonies during the course of a reprogramming experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig2large.jpg" target="_blank"> Click here to view larger figure</a>.
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig3.jpg" /> 
Figure 3. Production of tetraploid embryos. Diploid two-cell embryos are subjected to an electric pulse resulting in blastomere fusion and generation of one-cell tetraploid embryos.
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig4.jpg" /> 
Figure 4. Production of iPSC mice. Left: iPSCs are injected into the blastocoel of a tetraploid blastocyst. Middle: Newborn iPSC mice are distinguished by pigmented eyes. Right: iPSC mouse at three weeks post-delivery.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generera inducerade pluripotenta stamceller (IPSC) linjer producerar rader av olika utvecklingspotential även när de passerar standardtester för pluripotens. Här beskriver vi ett protokoll för att producera möss som helt och hållet från iPSCs, som definierar de IPSC linjer som besitter fullt pluripotens<sup&gt; 1</sup&gt;.

Generering av möss härledda från inducerade pluripotenta stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Generering av inducerade pluripotenta stamceller genom att programmera om musen Embryonala fibroblasts med en fyra transkriptionsfaktor, Doxycyklin inducerbara Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Generering av inducerade pluripotenta stamceller genom att programmera humana med Stemgent mänskliga TF lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfektering och Nucleofecting Human inducerade pluripotenta stamceller

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Välja och isolera Kolonier av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller omprogrammeras från vuxna fibroblaster

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering Mänskliga somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) Använda retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Generering av Human inducerade pluripotenta stamceller från perifert blod Använda STEMCCA lentivirusvektorn

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Snabb och effektiv generering av nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller i en Multititre Plate format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av Human Cardiomyocytes: differentiering protokoll från Feeder-fria mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Human inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...