Name: planarian immobilization, partial irradiation, and tissue transplantation
Uploaded: 2012-08-06T12:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare Chiyoko Kobayashi e Kiyokazu Agata per utili consigli sul trapianto di planaria così come i membri passati e presenti del laboratorio per le discussioni Sánchez preziosi durante lo sviluppo di queste tecniche. Questo lavoro è stato supportato dal NIH Training Grant (5T32 HD0791) per OCG e NIH R37GM057260 ad ASA. ASA è un Howard Hughes Medical Institute.

Nota: questo protocollo suggerisce l&#39;uso di materiali potenzialmente pericolosi (piombo e chloretone). Acquisire, leggere e seguire MSDS per tutti i materiali potenzialmente pericolosi. 1. Animal Cultura, selezione e preparazione <ol><li> Per la cultura degli animali e l&#39;uso dell&#39;acqua manipolazione planaria (1X sali di Montjuïc 9) e pipette di plastica. </li><li> Sexual biotipo Schmidtea mediterranea può essere utilizzato quando sollevate...

<ol>
	<li>Morgan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+of+the+regeneration+of+Planaria+maculata.">Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata.</a> Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 .</li><li>Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+planarian+regeneration.">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).</li><li>Randolph, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regeneration+of+the+tail+in+lumbriculus.">The regeneration of the tail in lumbriculus.</a> J. Morphol. 7, 317-344 .</li><li>Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. 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Zo&#246;l. 3, 269-294 (1906).</li><li>Dubois, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+&#225;+l+'&#232;tude+de+la+migration+des+cellules+de+règènèration+chez+les+Planaires+dulcicoles.">Contribution &#225; l '&#232;tude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles.</a> Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).</li><li>Purton, L. E., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays.">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell Stem Cell. 1, 263-270 (2007).</li><li>Cebria, F., Newmark, P. 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Dyn. 238, 443-450 (2009).</li><li>Hayashi, T., Asami, M., Higuchi, S., Shibata, N., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+planarian+X-ray-sensitive+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Dev. Growth Differ. 48, 371-380 (2006).</li><li>Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+secreted+Wnt+pathway+components+reveals+unexpected+complexity+of+the+planarian+amputation+response.">Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response.</a> Dev. Biol. 347, 24-39 (2010).</li><li>Salvetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cell+plasticity:+neoblast+repopulation+in+non-lethally+irradiated+planarians.">Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians.</a> Dev. Biol. 328, 305-314 (2009).</li></ol>

Importanza di immobilizzazione L&#39;immobilizzazione è di gran lunga il passo più critico per il completamento di qualsiasi di questi processi. Se planaria sono impropriamente immobilizzati prima dell&#39;irradiazione parziale, possono muoversi sotto lo scudo di piombo, producendo risultati inconsistenti e confusione. Inoltre, se gli animali sono sufficientemente immobilizzati dopo il trapianto, il verme host probabilmente allontanarsi dal tessuto innesto, con conseguente fallimento del trap...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> General Purpose pipetta di trasferimento </td><td> Samco </td><td> 691 </td></tr><tr><td> Tubi capillari (ID 0,75 mm) </td><td> FHC </td><td> 30-30-0 </td></tr><tr><td> Tubi capillari (diametro esterno 0,7 mm) </td><td> FHC </td><td> 30-50-08 </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> VWR </td><td> 52858-076 </td></tr><tr><td> Kimwipes 34155 </td><td> VWR </td><td> 500029-891 </td></tr><tr><td> Nero carta da filtro </td><td> Schleicher &amp; Schuell </td><td> 10310809 </td></tr><tr><td> Whatman # 2 filtro di carta 1002-055 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-810b </td></tr><tr><td> Whatman # 3 filtro di carta 1003-185 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-820E </td></tr><tr><td> Cigarette rolling paper </td><td> Zig-Zag, originale </td><td> NA </td></tr><tr><td> Petripiatti </td><td> VWR </td><td> 82050-544 </td></tr><tr><td> Pinza DUMONT, INOX # 5 </td><td> FST </td><td> 11251-20 </td></tr><tr><td> Chloretone </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 112054 </td></tr><tr><td> Caseina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C3400 </td></tr><tr><td> Piombo Shields </td><td> Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT </td><td> Design personalizzato </td></tr><tr><td> XRAD-320 Irradiator biologica </td><td> Precision X-Ray, North Branford, CT </td><td> NA </td></tr></tbody></table>

planarian immobilization, partial irradiation, and tissue transplantation

La planaria, un verme piatto d&#39;acqua dolce, ha dimostrato di essere un potente sistema per la rigenerazione dei metazoi dissezione e la biologia delle cellule staminali 1,2. Rigenerazione planaria di eventuali tessuti mancanti o danneggiate è resa possibile da cellule staminali adulte chiamato neoblasts 3. Anche se queste cellule staminali sono state definitivamente dimostrato di essere pluripotenti e singolarmente in grado di ricostituire un animale intero 4, l&#39;eterogeneità all&#39;interno della popolazione di cellule staminali e le dinamiche dei loro comportamenti cellulari rimangono in gran parte irrisolti. A causa del numero elevato e ampia distribuzione di cellule staminali in tutto il corpo piano planarian, metodi avanzati per manipolare sottopopolazioni di cellule staminali per lo studio molecolare e funzionale in vivo sono necessari. Trapianto di tessuti e di irradiazione parziale sono due metodi con cui una sottopopolazione di cellule staminali planaria possono essere isolati per ulteriori studi. Ogni tecnica ha i suoi vantaggi distinti. Ttrapianto questione permette l&#39;introduzione di cellule staminali, in un ospite ingenuo, che sono intrinsecamente o geneticamente distinte o sono stati precedentemente trattati farmacologicamente. In alternativa, irradiazione parziale consente l&#39;isolamento di cellule staminali all&#39;interno di un host, giustapposti al tessuto privo di cellule staminali, senza l&#39;introduzione di una ferita o culatta in integrità dei tessuti. Utilizzando questi due metodi, si può indagare sui fattori cellulari autonomi e non autonomi che controllano le staminali funzioni cellulari, quali la proliferazione, la differenziazione e la migrazione. Sia il trapianto di tessuti 5,6 e l&#39;irradiazione parziale 7 sono state utilizzate storicamente nella definizione molte delle domande circa la rigenerazione planaria che rimangono in fase di studio oggi. Tuttavia, queste tecniche sono rimaste sottoutilizzate a causa della natura laboriosa e incoerente dei metodi precedenti. I protocolli presentati qui rappresentano un grande passo in avanti nel ridurre il tempo di unond sforzo necessario per generare in modo riproducibile un gran numero di animali innestati o parzialmente irradiato con efficacie che si avvicinano al 100 per cento. Copriamo la cultura degli animali di grandi dimensioni, l&#39;immobilizzazione, la preparazione per l&#39;irradiazione parziale, il trapianto di tessuti, e l&#39;ottimizzazione del recupero degli animali. Inoltre, il lavoro qui descritto dimostra la prima applicazione del metodo irradiazione parziale per l&#39;uso con la planarian più ampiamente studiato, Schmidtea mediterranea. Inoltre, il tessuto efficiente innesto in planaria apre la porta per il test funzionale di sottopopolazioni di cellule staminali naive o trattati in saggi di ripopolamento, che ha da tempo il metodo di gold-standard di saggiare il potenziale delle cellule staminali dell&#39;adulto nei mammiferi 8. Ampia adozione di queste tecniche sarà senza dubbio portato ad una migliore comprensione dei comportamenti cellulari di cellule staminali adulte durante l&#39;omeostasi dei tessuti e la rigenerazione.

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Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

Un metodo efficace per l&#39;innesto di tessuto di dimensione definita e coerente tra planaria è descritto. È inclusa anche una descrizione di come la tecnica di immobilizzazione utilizzata per il trapianto può essere adattato, in combinazione con scudi piombo, per l&#39;irradiazione parziale di animali vivi.

Planaria immobilizzazione, irradiazione parziale, e di tessuti

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