Name: a quantitative fitness analysis workflow
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fitness Analysis Workflow at JoVE.com

Vi takker for alle medlemmer af vores laboratorium og Center for Integreret Systembiologi af aldring og ernæring (CISBAN) for støtte og nyttige diskussioner. Denne undersøgelse blev støttet af bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) og Wellcome Trust (075.294, 093.088).

Manuel QFA protokol (for S. cerevisiae-stammer) 1. Dyrkning Gærstammer <ol><li> Op til 96 uafhængige gærstammer dyrkes i 200 pi rige flydende medier i en 96-brønds dyrkningsplade. Stammerne dyrkes til mætning i et temperaturstyret inkubator. </li><li> En 96 pin 1/8 &quot;diameter manuel replika Plater (SIGMA R-2508) steriliseres ved først at dyppe replika Plater i 100% ethanol, brændende og derefter forlader at afkøle. </li><li> 200 ul sterilt vand er opstillet i en 96-brønds kulturplade. De mættede kulturer hvirvles (Eppendorf MixMate, 30 sek, 750 rpm) og fortyndes ved at dyppe det steriliserede stiften værktøjet til mættede stammerne tre gange så ind i pladen indeholdende vand en gang. </li><li> Tappen Værktøjet resteriliseres pr 1,2. </li><li> Den steriliserede stift værktøj anvendes til at spotte den fortyndede kultur på sælges agarplader ved neddypning i pladen med den fortyndede kultur tre gangen overføre stiften værktøj til et rektangulært legeme agarplade. </li><li> De rektangulære faste Agarpladerne inkuberes ved en passende temperatur, før der afbildes manuelt med en S &amp; P Robotics spImager. Alternative image capture metoder kan også bruges som en FujiFilm LAS4000, eller en billigere digital SLR kamera, hvis der gøres en indsats for at sikre en jævn belysning og konsekvent plade positionering i forhold til kamera. </li><li> Fremgangsmåden kan tilpasses til et mindre antal parallelle kulturer, såsom 48, der kan monteres på runde petriskåle hvis man sørger for at sikre den samme vinkel i forhold til afbildningskamera under hver fotografi. </li></ol> Fuldt Automatiseret QFA Protokol (for S. cerevisiae stammer) 2. Dyrkning Gærstammer <ol><li> Start med en rektangulær række uafhængige gærstammer vokser på fast agar. I dette eksempel begynder stammer er resultatet af passerer en temperaturfølsomme forespørgsel mutation med Gær sletning Collection (YDC) ved Syntetisk Genetisk Array (SGA). Afsluttende SGA plader er i 1536-format. Dette er 16 rækker med 24 kolonner kolonier / kulturer repræsenterer fire gentagelser af 384 uafhængige gærstammer. Se figur 1 for plade layouts. </li><li> 384 stammer ud af 1536 overføres robot med en S &amp; P Robotics Inc BM3-SC robot med en 96 pin 1 mm pin diameter steril pintool i fire 96-brønds dyrkningsplader indeholdende 200 ul af selektive medier (fig. 1). Pintool renlighed og sterilitet opnås ved sekventielt vasket i sterilt vand to gange (en gang med en roterende børste til fjernelse af rester), 70% ethanol (med sonikering) og 100% ethanol. </li><li> Kulturerne dyrkes til mætning (i tre dage ved 20 ° C i dette eksempel, se figur 1). </li></ol> 3. Spotting gærkulturer <ol><li> Ved hjælp af en Beckman Biomek FX, mættede kulturer enre resuspenderet ved hvirvelbehandling i en Variomag Teleshake (mod uret ved 1000 rpm i 20 sekunder) og fortyndet ca 1:70 ved at fastgøre i 200 ul sterilt vand med en steril 96 stift robot pin værktøj (V &amp; P Scientific magnetisk montering pintool, 2 mm stift diameter). Pin værktøjet renlighed og sterilitet opnås ved vask i sterilt vand, vask i 70% ethanol (med en børste til fjernelse af urenheder) og endelig neddypning i 70% ethanol efterfulgt af tørring. </li><li> Udvandet kulturer er plettet på fast agar plader i 384 format med det samme robot-pin værktøj (se figur 1) efter rengøring og sterilisering. </li><li> Efter pinning, pladerne overføres til en Cytomat temperaturstyret, befugtet inkubator med automatisk karrusel og adgang luge. </li></ol> 4. Billedoverførsel <ol><li> En S &amp; P Robotics automatiseret imager gange fjerner pladerne fra Cytomat inkubator, fjerner pladen låget, placerer dem præcist under en vedlægged, ensartet belyst rum under et Canon EOS Rebel Ti 35mm DSLR, fanger et billede på 5184 x 3456 px opløsning, erstatter pladen låget, og returnerer dem til inkubator karrusellen. Et billede indfanges umiddelbart efter første overførsel til inkubatoren for at muliggøre en nul-tidspunktet vækst måling (baggrund). Robot håndtering og fotografering tager 2 minutter per plade. </li><li> Med en fuldt lastet karrusel, er den maksimalt opnåelige pladen billedoptagelse frekvensen et fotografi hver sjette time. Pladerne inkuberes i op til seks dage (indtil kolonivækst mætning. Figur 1 viser tre typiske billeder fra en tid-kursus ved 20 ° C. </li><li> Til sporing, pladerne opkaldt efter inkubator navn, temperatur, unikt fortløbende batchnummer og placering i inkubatoren. Billede navne er en sammenkædning af plade navn og tidsstempel og bliver automatisk opbygget ved billedoptagelse (f.eks K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg, Filtype FT1, Tabel 1). </li></ol> 5. Fangst af Eksperimentel Metadata De metadata filer, der er beskrevet i dette afsnit, er tabulatorseparerede tekstfiler, som manuelt genereres (fx anvendelse af regneark). Experimental Beskrivelse fil (FT2, tabel 1) er unik for hvert eksperiment, men biblioteket Beskrivelse (FT3, tabel 1) kan genbruges udstrakt gang konstrueret. <ol><li> Forsøget er beskrevet i den eksperimentelle beskrivelse fil (FT2, Tabel 1), der indeholder kolonner til stregkode (eller automatisk genereret plade navn), eksperiment starter tidsstempel, plade behandling, indholdet af fast agar medium, skærmnavn, bibliotek, plade nummer (for biblioteker med flere plader), og en gentagelse-kvadrant nummer (se figur 1) for at skalere ned fra 1536 format til 384 format. </li><li> Gærstammen bibliotek er beskrevet med et bibliotek beskrivelse fil (FT3, <strong&gt; Tabel1) med angivelse af genotypen dyrkes i hver kultur sted i hver plade af et bibliotek. Det indeholder kolonner til: bibliotek navn, ORF, plade nummer, tallerken række, pladekolonne og en valgfri noter kolonne. </li><li> En valgfri Standard Gene Navn fil (FT4, tabel 1) at beskrive standard genet navn (f.eks RAD9) knyttet til hver systematisk ORF y-nummer (f.eks YDR217C) identificere stammer bliver screenet kan tilvejebringes. Denne fil indeholder to kolonner: ORF &amp; Gene navn. </li></ol> 6. Dataanalyse Den QFA beregningsmæssige workflow kræver adgang til en rimelig kraftig kerner computerarbejdsplads (fx en Dell Precision T3500 med Xeon quad-core 2,67 GHz processor og 12GB RAM), hvorpå der er installeret Colonyzer billedet analyse software-værktøj 3,4 og QFA R pakken 7 , der begge er dokumenteret på nettet, er frit tilgængelige og køre på en vifte af operativsystemer. <ol><li>Kør Colonyzer med hver af de tilfangetagne plade billederne som input, genererer en Colonyzer Output fil (FT5 tabel 1) for hvert optaget billede. Colonyzer Outputfilerne angive Dyrkningstætheden skøn kultur området, form og farve for hver af de 384 steder på den billeddannede pladen. Output filnavn kopieres automatisk fra kilden billedet filnavn (f.eks pladen fotografiet K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1, tabel 1) svarer til Colonyzer outputfil K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat ( FT5, tabel 1)). </li><li> Brug af QFA R pakken, indlæse eksperimentel metadata (FT2, Tabel 1) og Colonyzer output-filer (FT5 tabel 1). Disse data er samlet i R datarammer (som kan eksporteres som QFA rådata tekstfiler (FT6, tabel 1)) til yderligere analyse. </li><li> Den QFA R Pakken indeholder funktioner til at samle celledensitet timecourses for hver kultur, til at passe generaliseret logistic populationsmodeller til bemærkninger og plot både (se figur 2 og 3 for eksempler). Monteret parameterværdier er skrevet til QFA Logistiske Parameter filer (FT7 tabel 1). Se QFA R pakke dokumentationen for yderligere detaljer. </li><li> Den QFA R Pakken indeholder også funktioner til kvalitetskontrol: kant kolonier kasseres på grund af den større tilgængelighed af næringsstoffer ved pladekanter og problemer med billede analyse nær plade vægge, kulturer, der ikke SGA og genotyper vise sammenhæng med skærm-specifikke markørgener strippes fra analysen. </li><li> Flere kvantitative fitness foranstaltninger er afledt fra logistiske populationsmodel parametre for hver kultur. Disse omfatter maksimale bestandsdata fordobling satser (MDR) og antal af divisioner fra podning til mætning (MDP). For hvert sæt af gentagne kulturer (af unikke genotype for eksempel) og for hver fitness definition er flere summariske statistikker fitness skøn compudloddet: middelværdi og median fitness, fitness standardafvigelse og antallet af gentagelser observeret. Sammenfatning statistikker udgang til QFA Fitness Sammenfatning filer (FT8, tabel 1) for yderligere analyse, fx beregning af genetiske interaktion scores (FT9 tabel 1). </li></ol> 7. Repræsentative resultater Figur 2 viser en typisk vækstkurve af 384 QFA kulturer voksende ved 20 ° C på fast agar som kvantificeret ved Colonyzer med stigningen i celletæthed første gang er blevet påviselige efter omkring 2 dage. Denne forsinkelse er sandsynligvis en kombination af en kultur lag-fase efter inokulering på fast medium, og en nedre detektionsgrænse for celletæthed. Figur 3 viser 308 lignende vækstkurverne optaget fra en enkelt plade. Figur 4 viser en sammenligning af to genom hele QFA skærme til at udlede genetiskeinteraktion styrker (tilpasset fra 1). Den QFA R Pakken 7 indeholder også funktioner til at producere figur 3 og udsende rangerede lister af de undersøgte genotyper og skøn af genetisk samspil styrke (GIS), sammen med en Q-værdi (falsk Discovery Rate (FDR) korrigeret p-værdi) for Betydningen af ​​observerede GIS. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4018/4018fig1.jpg" /> Figur 1. Ordning for robot inokulering af gærstammer i 384-stedet format. Proceduren begynder med 1536 uafhængige kulturer per plade (venstre). I dette typisk eksempel kolonier i positionerne 1,1, 1,2, 2,1 og 2,2 (rødt) er fire gentagelser af den samme genotype his3 :: KanMX kulturer i gult, vokser på kanten af pladen. , har en vækst fordel på grund af manglende konkurrence, og bliver derfor ikke gennemgået af QFA. En af disse gentagelser (f.eks 1,1) inokuleres i flydende vækstmedier i 96-brønds plade<html> s anvendelse af en 96-bens værktøj, der vaccinerer 96 ud af 1536 kolonier hver gang. For at inokulere en gentagelse for hver 384 gendeletionerne fire forskellige &quot;-kvadranterne&quot; (angivet som rød, blå, grøn og lilla) inokuleres i fire forskellige 96-brønds plader indeholdende vækstmedium. Efter vækst til mætning (fx 3 dage ved 20 ° C), er kulturer fortyndes i vand, hvorefter de fire kvadranter fra en gentagelse er plettet på 384-format på en fast agarplade (højre) i det samme mønster som det oprindelige SGA plade (som angivet ved farve). Processen kan gentages for at teste andre replikerer: 1,2, 2,1 og 2,2. Eksempel time-lapse billederne til højre blev fanget 0,5, 2 og 3,5 dage efter podning. Tilpasset fra Supplerende figur 1 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . 018/4018fig2.jpg &quot;/&gt; Figur 2. En enkelt robot-fanget QFA vækstkurve. A) QFA vækstkurve af en gærstamme vokser på agar indeholdende galactose ved 20 ° C. Billeder blev taget til fange robotersvejsede cirka hver 2 timer. Eksponentielle fase ved denne temperatur blev observeres i ca 1,5 dage med kultur densitet stigning første gang er blevet detekterbar cirka 2 dage efter inokulering. En generaliseret logistiske model var egnet til at de observerede data (grå kurve). Modelparametre automatisk monteret af QFA R pakken præsenteres: K (lasteevne (AU)), R (vækstrate (d -1)), g (inokulum densitet (AU)), v (vækst symmetri). B) Hvad angår panel A, med celledensitet på en logaritmisk skala plottet. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4018/4018fig3.jpg" /> Figur 3. Automatisk gen<html> bedømt vækstkurver fanget parallelt fra et enkelt 384-format plade. Hvert panel viser celledensitet skøn (røde kors) og model fit (sorte kurver) for selvstændige kulturer mærket med gen-navn eller ORF y-nummer dyrkes i et QFA procedure. Dette eksempel plade blev afbildet ved robot og dyrket i en automatiseret inkubator ved 20 ° C. Eksperimentel metadata medtages automatisk i figuren titlen: plade navn, plade behandling, agar medium og bibliotek plade nummer. Fitningsmetode parameterværdier også automatisk trykt på hvert panel (se figur 2). Edge kulturer blev fjernet fra QFA analyse, efterlader de 308 kulturer i dette plot (se QFA protokollen 5,4). Idet kant kulturer ikke analyseres i QFA er disse dyrkningsbetingelser steder typisk fyldt med neutrale kontrolstammer (pGAL-HIS3 i dette tilfælde). Den oprindelige version af dette tal, udgang ved QFA R-pakken, er i. Pdf-format og er derfor uendeligt zoomable og søgbart tekst forespørgsler.:/ / Www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig3.pdf &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik her for at se større figur. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4018/4018fig4.jpg" /> Figur 4. Sammenligning fitnesses fra to QFA skærme til at udlede genetiske interaktion. Dette plot viser sammenligning af egnethed spirende gær deletioner (yfgΔ) kombineret med den neutrale ura3Δ mutation eller temperaturfølsomme CDC13-1 mutation og dyrket på semi-tilladelige temperatur for CDC13- 1 (27 ° C). Fitness blev beregnet som produktet af den maksimale fordobling procentsatsen og det maksimale fordobling potentiale 1. De fleste deletionsstammer vokser godt, når de kombineres med den neutrale ura3Δ mutation, som forventet, og har høj formen men deletioner kombineret med CDC13-1 har en bred vifte af fitnesses. De lyseblå linier krydser på the placering af den neutrale his3Δ mutationen, den fuldt optrukne linie er en lineær regressionsanalyse af den genetiske uafhængighed (forventet egnethed CDC13-1 yfgΔ mutanter viste egnethed ura3Δ yfgΔ mutanter) og den stiplede linie er den linie lige form. Sletninger farvet grøn i høj grad styrke egnethed defekt i CDC13-1 stammer. Sletninger farvet rød betydeligt undertrykker den samme defekt. Lodret afstand af en mutation CDC13-1 yfgΔ fra den fuldt optrukne linie angiver styrken af genetiske interaktion mellem CDC13-1 og yfgΔ under pladen betingelser. Bemærk, at nogle af de stærkeste suppressorer af CDC13-1 som tidligere er identificeret checkpoint gener, RAD17, DDC1 og RAD24 og nuklease EXO1 øverst til højre. Gener, hvis sletning reducerer fitness omfatter YKU80 (koder for DNA-reparation og telomer capping protein YKU80) nær<html> nederst til højre. Bemærk også, at nogle grupper af gener, der fungerer sammen en tendens til at blive placeret på dette plot. Tre eksempel klynger er fremhævet med blåt SPE1, SPE2 og SPE3: spermidin syntese gener, RAD17 og DDC1 og RAD24: kodning komponenter i Checkpoint glidende klemme og checkpoint klemme loader, MRE11, RAD50 og XRS2: den MRX kompleks, der er involveret i DDR og EST1 &amp; EST3: gener involveret i telomerlængde regulering. Tilpasset fra Supplerende figur 1B 1, kan rådata hvorfra dette plot blev genereret hentes her: <a href="http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/" target="_blank">http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/</a> . <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig4.pdf" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . &quot;&gt; <tbody><tr><td> Fil-id </td><td> File Type </td><td> Manuelt Konstrueret </td><td> Opdater Frekvens </td><td> Forudsætning </td></tr><tr><td> FT1 </td><td> Plate fotografi </td><td> Ingen </td><td> Per plade og tidspunkterne </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT2 </td><td> Eksperimentel Beskrivelse </td><td> Ja </td><td> Per eksperiment </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT3 </td><td> Bibliotek Beskrivelse </td><td> Ja </td><td> Per bibliotek </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT4 </td><td> Standard Gene Navne </td><td> Ja </td><td> Per bibliotek </td><td> Ingen </td></tr><tr><td> FT5 </td><td> Colonyzer Udsend </td><td> Ingen </td><td> Per tidspunkterne per plade </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT6 </td><td> QFA Rådata </td><td> Ingen </td><td> Per eksperiment </td><td> - </td></tr><tr><td> FT7 </td><tD&gt; QFA Logistic parametre </td><td> Ingen </td><td> Per eksperiment </td><td> - </td></tr><tr><td> FT8 </td><td> QFA Fitness Oversigt </td><td> Ingen </td><td> Per eksperiment </td><td> - </td></tr><tr><td> FT9 </td><td> QFA Genetisk Interaktion hitlisten </td><td> Ingen </td><td> Per GIS undersøgelse (2 expts.) </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Elektroniske QFA filer. Alle de anførte filer (bortset fra FT1) er tabulatorseparerede tekstfiler og kan konstrueres eller læses ved hjælp af en teksteditor eller regneark. For yderligere oplysninger om at opbygge QFA metadata filer og præcise fortolkning af QFA output se QFA R pakken dokumentation 7 og Colonyzer softwaredokumentationen 3. <img src="/files/ftp_upload/4018/4018table2.jpg" alt="Tabel 2" /> Tabel 2 nedenfor. Metoder til vurdering kultur fitness. En sammenfatning af funktioner og krævermenter i en række metoder til vurdering af mikrobielle kultur fitness. En gennemgang af Blomberg 8 indeholder en mere detaljeret sammenligning af nogle af disse. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018table2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> .

<ol>
	<li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects.">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362 (2011).</li><li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li><li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonyzer:+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar.">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li><li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping.">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li><li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70&#916;mutants.">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70&#916;mutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li><li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li><li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li><li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries.">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864 (2011).</li><li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants.">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li><li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+ecology:+The+social+side+of+wild+yeast.">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

QFA er på mange måder en direkte efterkommer af tre etablerede bench-skala mikrobiologiske teknikker: kultur fortyndingsrække stikprøver 9, vækstkurven bestemmelse i vand tilsat flydende kulturer 9 og replikaudpladning 13. Disse tre fremgangsmåder er opsummeret og sammenlignet med QFA og andre højt gennemløb teknikker i tabel 2. Ud fra følgende betragtninger fortyndingsrække stikprøver definerer en stamme egnethed som sin evne til at danne kolonier i en serie af kulturer dyrket fra en række af inokulum fortyndinger, at QFA foranstaltninger belastning fitness ved gentagne observationer af en enkelt kultur konstruere en vækstkurve. Kvantificering fitness fra enkelte kulturer giver mange flere stammer, der skal undersøges samtidigt, under identiske betingelser. Replikerende arrays af kulturer tillader gentagne test af stamme samlinger, mest nyttig ved test for kultur fitness forskelle i forskellige miljøer eller genetiske baggrunde. Den QFA protokol præsenteretHer anvender kostbart robotudstyr til at replikere, inokulere, inkuberes og billeddata agarplader, passende for at observere vækst af tusinder af uafhængige kulturer (robot QFA, tabel 2). Men da QFA bygger på etablerede, traditionelle laboratorieteknikker, kan det også udføres langt billigere ved at erstatte robot bistand i forbindelse med manuelle trin (manuel QFA, tabel 2). Manuel QFA indebærer replikation og podning af kulturer på agarplader ved hjælp af en manuel pin værktøj og manuel overførsel af plader til og fra en inkubator til fotografering. Den samme Computeranalyse arbejdsgang kan anvendes til at generere vækstkurverne fra begge eksperimentelle design. QFA fitness estimater synes at være forholdsvis præcist. I figur 4 er de gennemsnitlige fitnesses fire eksempel klynger af funktionelt beslægtede gendeletioner fremhævet. Nærheden af ​​medlemmer af hvert funktionelt relateret gen klasse i to uafskellige genetiske baggrunde (ura3Δ og CDC13-1) angiver reproducerbarheden af QFA fitness skøn. For eksempel adskiller kun 3 gendeletioner (ud af en mulig 4300) tre medlemmer af den konserverede MRX komplekset. High-throughput alternativer til QFA for afprøvning vækstkarakteristika af mikrobielle stammer indbefatter SGA 5,6, konkurrence skærme i stregkodede biblioteker 11,12 og skærme indfangningsproceduren optiske densitet kinetik i spektrofotometriske plade læser 10, der er opsummeret i tabel 2 og er beskrevet mere fuldstændigt andetsteds 8 . QFA og SGA plader, hvor kulturer vokser på fast agar overflader (agar-baserede metoder, tabel 2) kan håndteres hurtigt og nemt med robot. Solid agaroverfladen kulturer er godt beluftet hele vækst og celler kan vokse i faste kulturer, så omgængelig mikrober til at vokse i et fællesskab 14. Efterlades intakt, mikrobielle samfund etffect deres mikromiljøer og secernerer toksiner såsom ethanol, og eventuelt signalering mellem celler. Men kontinuerlig blanding af flydende kulturer, der er nødvendige for at opnå tilstrækkelig beluftning, kunstigt forstyrrer mikrobielle samfund og deres mikro-miljøer, som kan påvirke deres former for vækst. Krydskontaminering er et mindre problem i fast agar metoder, da der er mindre mulighed for væskesprøjt bærende celler mellem kulturer. Hvis kontaminering forekommer ved fremmede luftbårne mikroorganismer i fast agar-assays, kan det ofte kan detekteres ved visuel inspektion af faste agarplader og udgjorde eller fjernes. QFA gennemløb er betydeligt højere end parallelle flydende metoder på to måder. Først og fremmest, om QFA (og SGA) plader, der er podede kulturer pakkes sammen mere tæt, hvilket giver flere uafhængige kulturer per plade. I QFA er der typisk 308 kulturer, ikke tælle ikke-eksperimentelle kant kulturer (fig. 1) KOMforhold til parallelt flydende kulturer med 96 eller 100 kulturer per plade. For det andet kan QFA eksperimenter skaleres til en meget større antal plader. Medens antallet af plader blev analyseret i et enkelt QFA eksperiment er kun begrænset af den tilgængelige plads i en inkubator eller varmt rum, den mindste tilladelige billedoptagelse frekvens og den maksimalt opnåelige indfangning frekvens, antallet af plader i en væske vækst eksperiment er stærkt begrænset ved evnen af ​​pladelæser (typisk en eller to plader), eller af stabler fastgjort til pladelæser (typisk 25-50 plader). Vi har for nylig gennemført en fuldt automatiseret QFA eksperiment på 123 plader, hver med 308 eksperimentelle kulturer, hvilket giver 37,884 samtidige kulturer. Vi vurderer, at det maksimalt opnåelige antal selvstændige kulturer, der vokser i væsken er 96 (kulturer / plade) x 50 (plader / stabler) = 4800, hvilket er omkring ti gange mindre end vores QFA gennemløb. En alternativ til flydende kultur skærme er at anvende mange automatiserede groWth enheder parallelt (tabel 1 fra gennemgangen af Blomberg 8), der hver har en kapacitet på en eller to plader. Temperatur kontrol i hver enhed er uafhængig, og det forhold er ikke identiske, men forudsat at de er, ville denne arbejdsproces kræver mindst 190 sådanne anordninger til at matche QFA gennemløb (under forudsætning af 200 flydende kulturer pr enhed). Sammenfattende er QFA en høj kvalitet arbejdsgang, der med fordel kan anvendes til at indsamle kvantitative vækst fænotyper i både små skala fokuserede eksperimenter og high-throughput skærme. Den er fleksibel nok til at blive anvendt effektivt med varierende krav til robotudstyr. Den beregningsmæssige del af QFA arbejdsgangen er baseret på frit tilgængelige, open source-kode.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens / udstyr </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> 96 stift manuel pintool med 1/8 &quot;diameter tappe </td></tr><tr><td> Bland Mate </td><td> Eppendorf </td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td> Beckman </td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td> Thermo Scientific </td><td> 50095890 </td><td> Installeret på Biomek FX </td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> BM3-SC </td><td> 192 hylde roterende karrusel </td></tr><tr><td> spImager </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> spImager </td><td> Høj opløsning manuel billedbehandling </td></tr><tr><td> spImager med Cytompå </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Brugerdefineret </td><td> Temperatur styres automatiseret høj opløsning billeddannelse </td></tr><tr><td> Cytomat 6001 med varmeveksler </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51022222 </td><td> Knyttet til spImager </td></tr><tr><td> Ecoline RE207 </td><td> Lauda </td><td> RE207 </td><td> Knyttet til Cytomat </td></tr><tr><td> spImager med karrusel </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Brugerdefineret </td><td> Automatiseret høj opløsning billeddannelse </td></tr><tr><td> Robotten pin værktøj fikstur til FP12pins </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 x FP12 ben </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> FP12 </td><td> 50,4 mm lang, 17 mm udsættes stift længde </td></tr><tr><td> Docking Station for Pin Tool </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP425 </td><td> Docking station basen fjernet for at tillade fan tørring af stifter </td></tr><tr><td>Pin Rensebørste </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> Manuel pin værktøj </td></tr><tr><td> Nunc OmniTray med låg </td><td> Nunc </td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 og sterile polystyrenplader </td><td> Greiner BioOne </td><td> 655161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 og sterile polystyren låg </td><td> Greiner BioOne </td><td> 656171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Specifikke reagenser og udstyr.

a quantitative fitness analysis workflow

Kvantitative Fitness Analyse (QFA) er en eksperimenterende og beregningsmæssige workflow til at sammenligne fitnesses af mikrobielle kulturer dyrket i parallel 1,2,3,4. QFA kan anvendes til fokuserede observationer af enkelte kulturer, men er mest nyttig for genom-dækkende genetiske interaktion eller narkotika skærme undersøge op til tusindvis af uafhængige kulturer. Den centrale eksperimentelle fremgangsmåde er inokulering af uafhængige, fortyndede flydende mikrobielle kulturer på faste agarplader, som blev inkuberet og regelmæssigt fotograferet. Billeder fra hvert tidspunkt analyseres, producerer kvantitative celledensitet estimater, som anvendes til at konstruere vækstkurver, så kvantitative fitness der skal udledes. Kultur fitnesses kan sammenlignes med kvantificere og rangordne genetiske interaktion styrker eller narkotika følsomhed. Effekten på kultur egnethed af eventuelle behandlinger tilføjet i underlaget agar (fx små molekyler, antibiotika eller næringsstoffer) eller anvendes på plader eksternly (f.eks UV-bestråling, temperatur) kan kvantificeres ved QFA. Den QFA arbejdsgang fremstiller væksthastighed anslår analoge til dem opnået ved spektrofotometrisk måling af parallelle flydende kulturer i 96-brønds eller 200-brøndplade læsere. Vigtigt, QFA har signifikant højere gennemløb sammenlignet med sådanne fremgangsmåder. QFA kulturer vokse på en fast agaroverfladen og er derfor godt beluftet under vækst uden behov for omrøring eller omrystning. QFA throughput er ikke så høj som for nogle syntetiske Genetisk Array (SGA) screeningsmetoder 5,6. Men da QFA kulturer er stærkt fortyndet, før de podet på agar, kan QFA fange mere komplette vækstkurver, herunder eksponentiel og farvemætning fase 3. For eksempel giver vækstkurven observationer kultur fordoblingstider skal estimeres direkte med høj præcision, som diskuteret tidligere 1. Her præsenterer vi enspecifik QFA protokol anvendes til tusindvis af S. cerevisiae kulturer, der håndteres automatisk af robotter i løbet af podning, inkubation og billedbehandling. Enhver af disse automatiserede trin kan erstattes af en tilsvarende, manuel procedure, med en tilhørende reduktion i gennemløb, og vi også præsentere en lavere overførselshastighed manuel protokol. De samme QFA softwareværktøjer kan anvendes på billeder taget i enten arbejdsgang. Vi har stor erfaring gælder QFA til kulturer af den spirende gær S. cerevisiae, men vi forventer, at QFA vil vise sig lige så nyttig for behandlingen kulturer fission gær S. pombe og bakteriekulturer.

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fitness Analysis Workflow at JoVE.com

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Kvantitative Fitness Analyse (QFA) er en supplerende serie af eksperimentelle og beregningsmæssige metoder til estimering af mikrobielle kultur fitnesses. QFA estimerer effekten af ​​genetiske mutationer, lægemidler eller andre anvendte behandlinger for mikrobe vækst. Forsøgene skalering af fokuserede analyse af enkelte kulturer til tusindvis af parallelle kulturer kan udformes.

En kvantitativ Fitness Analyse Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitative levende celler fluorescens-mikroskopi Analyse af Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analyse af Random migration af celler Brug af Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kvantitativ analyse af Autophagy hjælp Advanced 3D fluorescensmikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse af mRNA molekyler under anvendelse Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

En High Throughput MHC II Bindende Assay til kvantitativ analyse af peptidepitoper

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

En ny teknik til kvantitativ analyse af hårtab i mus Brug gråtoner Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplet Workflow for Analyse af Histon post-translationelle modifikationer Brug Bottom-up-massespektrometri: Fra Histon Extraction til dataanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...