Name: a quantitative fitness analysis workflow
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fitness Analysis Workflow at JoVE.com

Vi takker for alle medlemmer af vores laboratorium og Center for Integreret Systembiologi af aldring og ernæring (CISBAN) for støtte og nyttige diskussioner. Denne undersøgelse blev støttet af bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) og Wellcome Trust (075.294, 093.088).

Manuel QFA protokol (for S. cerevisiae-stammer) 1. Dyrkning Gærstammer <ol><li> Op til 96 uafhængige gærstammer dyrkes i 200 pi rige flydende medier i en 96-brønds dyrkningsplade. Stammerne dyrkes til mætning i et temperaturstyret inkubator. </li><li> En 96 pin 1/8 &quot;diameter manuel replika Plater (SIGMA R-2508) steriliseres ved først at dyppe replika Plater i 100% ethanol, brændende og derefter forlader at afkøle. </li><li> 200 ul sterilt vand er opstillet i en 96-brønds kulturplade. De mættede kulturer hvirvles (Eppendorf MixMate, 30 sek, 750 rpm) og fortyndes ved at dyppe det steriliserede stiften værktøjet til mættede stammerne tre gange så ind i pladen indeholdende vand en gang. </li><li> Tappen Værktøjet resteriliseres pr 1,2. </li><li> Den steriliserede stift værktøj anvendes til at spotte den fortyndede kultur på sælges agarplader ved neddypning i pladen med den fortyndede kultur tre gangen overføre stiften værktøj til et rektangulært legeme agarplade. </li><li> De rektangulære faste Agarpladerne inkuberes ved en passende temperatur, før der afbildes manuelt med en S &amp; P Robotics spImager. Alternative image capture metoder kan også bruges som en FujiFilm LAS4000, eller en billigere digital SLR kamera, hvis der gøres en indsats for at sikre en jævn belysning og konsekvent plade positionering i forhold til kamera. </li><li> Fremgangsmåden kan tilpasses til et mindre antal parallelle kulturer, såsom 48, der kan monteres på runde petriskåle hvis man sørger for at sikre den samme vinkel i forhold til afbildningskamera under hver fotografi. </li></ol> Fuldt Automatiseret QFA Protokol (for S. cerevisiae stammer) 2. Dyrkning Gærstammer <ol><li> Start med en rektangulær række uafhængige gærstammer vokser på fast agar. I dette eksempel begynder stammer er resultatet af passerer en temperaturfølsomme forespørgsel mutation med Gær sletning Collection (YDC) ved Syntetisk Genetisk Array (SGA). Afsluttende SGA plader er i 1536-format. Dette er 16 rækker med 24 kolonner kolonier / kulturer repræsenterer fire gentagelser af 384 uafhængige gærstammer. Se figur 1 for plade layouts. </li><li> 384 stammer ud af 1536 overføres robot med en S &amp; P Robotics Inc BM3-SC robot med en 96 pin 1 mm pin diameter steril pintool i fire 96-brønds dyrkningsplader indeholdende 200 ul af selektive medier (fig. 1). Pintool renlighed og sterilitet opnås ved sekventielt vasket i sterilt vand to gange (en gang med en roterende børste til fjernelse af rester), 70% ethanol (med sonikering) og 100% ethanol. </li><li> Kulturerne dyrkes til mætning (i tre dage ved 20 ° C i dette eksempel, se figur 1). </li></ol> 3. Spotting gærkulturer <ol><li> Ved hjælp af en Beckman Biomek FX, mættede kulturer enre resuspenderet ved hvirvelbehandling i en Variomag Teleshake (mod uret ved 1000 rpm i 20 sekunder) og fortyndet ca 1:70 ved at fastgøre i 200 ul sterilt vand med en steril 96 stift robot pin værktøj (V &amp; P Scientific magnetisk montering pintool, 2 mm stift diameter). Pin værktøjet renlighed og sterilitet opnås ved vask i sterilt vand, vask i 70% ethanol (med en børste til fjernelse af urenheder) og endelig neddypning i 70% ethanol efterfulgt af tørring. </li><li> Udvandet kulturer er plettet på fast agar plader i 384 format med det samme robot-pin værktøj (se figur 1) efter rengøring og sterilisering. </li><li> Efter pinning, pladerne overføres til en Cytomat temperaturstyret, befugtet inkubator med automatisk karrusel og adgang luge. </li></ol> 4. Billedoverførsel <ol><li> En S &amp; P Robotics automatiseret imager gange fjerner pladerne fra Cytomat inkubator, fjerner pladen låget, placerer dem præcist under en vedlægged, ensartet belyst rum under et Canon EOS Rebel Ti 35mm DSLR, fanger et billede på 5184 x 3456 px opløsning, erstatter pladen låget, og returnerer dem til inkubator karrusellen. Et billede indfanges umiddelbart efter første overførsel til inkubatoren for at muliggøre en nul-tidspunktet vækst måling (baggrund). Robot håndtering og fotografering tager 2 minutter per plade. </li><li> Med en fuldt lastet karrusel, er den maksimalt opnåelige pladen billedoptagelse frekvensen et fotografi hver sjette time. Pladerne inkuberes i op til seks dage (indtil kolonivækst mætning. Figur 1 viser tre typiske billeder fra en tid-kursus ved 20 ° C. </li><li> Til sporing, pladerne opkaldt efter inkubator navn, temperatur, unikt fortløbende batchnummer og placering i inkubatoren. Billede navne er en sammenkædning af plade navn og tidsstempel og bliver automatisk opbygget ved billedoptagelse (f.eks K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg, Filtype FT1, Tabel 1). </li></ol> 5. Fangst af Eksperimentel Metadata De metadata filer, der er beskrevet i dette afsnit, er tabulatorseparerede tekstfiler, som manuelt genereres (fx anvendelse af regneark). Experimental Beskrivelse fil (FT2, tabel 1) er unik for hvert eksperiment, men biblioteket Beskrivelse (FT3, tabel 1) kan genbruges udstrakt gang konstrueret. <ol><li> Forsøget er beskrevet i den eksperimentelle beskrivelse fil (FT2, Tabel 1), der indeholder kolonner til stregkode (eller automatisk genereret plade navn), eksperiment starter tidsstempel, plade behandling, indholdet af fast agar medium, skærmnavn, bibliotek, plade nummer (for biblioteker med flere plader), og en gentagelse-kvadrant nummer (se figur 1) for at skalere ned fra 1536 format til 384 format. </li><li> Gærstammen bibliotek er beskrevet med et bibliotek beskrivelse fil (FT3, <strong&gt; Tabel1) med angivelse af genotypen dyrkes i hver kultur sted i hver plade af et bibliotek. Det indeholder kolonner til: bibliotek navn, ORF, plade nummer, tallerken række, pladekolonne og en valgfri noter kolonne. </li><li> En valgfri Standard Gene Navn fil (FT4, tabel 1) at beskrive standard genet navn (f.eks RAD9) knyttet til hver systematisk ORF y-nummer (f.eks YDR217C) identificere stammer bliver screenet kan tilvejebringes. Denne fil indeholder to kolonner: ORF &amp; Gene navn. </li></ol> 6. Dataanalyse Den QFA beregningsmæssige workflow kræver adgang til en rimelig kraftig kerner computerarbejdsplads (fx en Dell Precision T3500 med Xeon quad-core 2,67 GHz processor og 12GB RAM), hvorpå der er installeret Colonyzer billedet analyse software-værktøj 3,4 og QFA R pakken 7 , der begge er dokumenteret på nettet, er frit tilgængelige og køre på en vifte af operativsystemer. <ol><li>Kør Colonyzer med hver af de tilfangetagne plade billederne som input, genererer en Colonyzer Output fil (FT5 tabel 1) for hvert optaget billede. Colonyzer Outputfilerne angive Dyrkningstætheden skøn kultur området, form og farve for hver af de 384 steder på den billeddannede pladen. Output filnavn kopieres automatisk fra kilden billedet filnavn (f.eks pladen fotografiet K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1, tabel 1) svarer til Colonyzer outputfil K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat ( FT5, tabel 1)). </li><li> Brug af QFA R pakken, indlæse eksperimentel metadata (FT2, Tabel 1) og Colonyzer output-filer (FT5 tabel 1). Disse data er samlet i R datarammer (som kan eksporteres som QFA rådata tekstfiler (FT6, tabel 1)) til yderligere analyse. </li><li> Den QFA R Pakken indeholder funktioner til at samle celledensitet timecourses for hver kultur, til at passe generaliseret logistic populationsmodeller til bemærkninger og plot både (se figur 2 og 3 for eksempler). Monteret parameterværdier er skrevet til QFA Logistiske Parameter filer (FT7 tabel 1). Se QFA R pakke dokumentationen for yderligere detaljer. </li><li> Den QFA R Pakken indeholder også funktioner til kvalitetskontrol: kant kolonier kasseres på grund af den større tilgængelighed af næringsstoffer ved pladekanter og problemer med billede analyse nær plade vægge, kulturer, der ikke SGA og genotyper vise sammenhæng med skærm-specifikke markørgener strippes fra analysen. </li><li> Flere kvantitative fitness foranstaltninger er afledt fra logistiske populationsmodel parametre for hver kultur. Disse omfatter maksimale bestandsdata fordobling satser (MDR) og antal af divisioner fra podning til mætning (MDP). For hvert sæt af gentagne kulturer (af unikke genotype for eksempel) og for hver fitness definition er flere summariske statistikker fitness skøn compudloddet: middelværdi og median fitness, fitness standardafvigelse og antallet af gentagelser observeret. Sammenfatning statistikker udgang til QFA Fitness Sammenfatning filer (FT8, tabel 1) for yderligere analyse, fx beregning af genetiske interaktion scores (FT9 tabel 1). </li></ol> 7. Repræsentative resultater Figur 2 viser en typisk vækstkurve af 384 QFA kulturer voksende ved 20 ° C på fast agar som kvantificeret ved Colonyzer med stigningen i celletæthed første gang er blevet påviselige efter omkring 2 dage. Denne forsinkelse er sandsynligvis en kombination af en kultur lag-fase efter inokulering på fast medium, og en nedre detektionsgrænse for celletæthed. Figur 3 viser 308 lignende vækstkurverne optaget fra en enkelt plade. Figur 4 viser en sammenligning af to genom hele QFA skærme til at udlede genetiskeinteraktion styrker (tilpasset fra 1). Den QFA R Pakken 7 indeholder også funktioner til at producere figur 3 og udsende rangerede lister af de undersøgte genotyper og skøn af genetisk samspil styrke (GIS), sammen med en Q-værdi (falsk Discovery Rate (FDR) korrigeret p-værdi) for Betydningen af ​​observerede GIS. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4018/4018fig1.jpg" /> Figur 1. Ordning for robot inokulering af gærstammer i 384-stedet format. Proceduren begynder med 1536 uafhængige kulturer per plade (venstre). I dette typisk eksempel kolonier i positionerne 1,1, 1,2, 2,1 og 2,2 (rødt) er fire gentagelser af den samme genotype his3 :: KanMX kulturer i gult, vokser på kanten af pladen. , har en vækst fordel på grund af manglende konkurrence, og bliver derfor ikke gennemgået af QFA. En af disse gentagelser (f.eks 1,1) inokuleres i flydende vækstmedier i 96-brønds plade<html> s anvendelse af en 96-bens værktøj, der vaccinerer 96 ud af 1536 kolonier hver gang. For at inokulere en gentagelse for hver 384 gendeletionerne fire forskellige &quot;-kvadranterne&quot; (angivet som rød, blå, grøn og lilla) inokuleres i fire forskellige 96-brønds plader indeholdende vækstmedium. Efter vækst til mætning (fx 3 dage ved 20 ° C), er kulturer fortyndes i vand, hvorefter de fire kvadranter fra en gentagelse er plettet på 384-format på en fast agarplade (højre) i det samme mønster som det oprindelige SGA plade (som angivet ved farve). Processen kan gentages for at teste andre replikerer: 1,2, 2,1 og 2,2. Eksempel time-lapse billederne til højre blev fanget 0,5, 2 og 3,5 dage efter podning. Tilpasset fra Supplerende figur 1 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . 018/4018fig2.jpg &quot;/&gt; Figur 2. En enkelt robot-fanget QFA vækstkurve. A) QFA vækstkurve af en gærstamme vokser på agar indeholdende galactose ved 20 ° C. Billeder blev taget til fange robotersvejsede cirka hver 2 timer. Eksponentielle fase ved denne temperatur blev observeres i ca 1,5 dage med kultur densitet stigning første gang er blevet detekterbar cirka 2 dage efter inokulering. En generaliseret logistiske model var egnet til at de observerede data (grå kurve). Modelparametre automatisk monteret af QFA R pakken præsenteres: K (lasteevne (AU)), R (vækstrate (d -1)), g (inokulum densitet (AU)), v (vækst symmetri). B) Hvad angår panel A, med celledensitet på en logaritmisk skala plottet. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4018/4018fig3.jpg" /> Figur 3. Automatisk gen<html> bedømt vækstkurver fanget parallelt fra et enkelt 384-format plade. Hvert panel viser celledensitet skøn (røde kors) og model fit (sorte kurver) for selvstændige kulturer mærket med gen-navn eller ORF y-nummer dyrkes i et QFA procedure. Dette eksempel plade blev afbildet ved robot og dyrket i en automatiseret inkubator ved 20 ° C. Eksperimentel metadata medtages automatisk i figuren titlen: plade navn, plade behandling, agar medium og bibliotek plade nummer. Fitningsmetode parameterværdier også automatisk trykt på hvert panel (se figur 2). Edge kulturer blev fjernet fra QFA analyse, efterlader de 308 kulturer i dette plot (se QFA protokollen 5,4). Idet kant kulturer ikke analyseres i QFA er disse dyrkningsbetingelser steder typisk fyldt med neutrale kontrolstammer (pGAL-HIS3 i dette tilfælde). Den oprindelige version af dette tal, udgang ved QFA R-pakken, er i. Pdf-format og er derfor uendeligt zoomable og søgbart tekst forespørgsler.:/ / Www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig3.pdf &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik her for at se større figur. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4018/4018fig4.jpg" /> Figur 4. Sammenligning fitnesses fra to QFA skærme til at udlede genetiske interaktion. Dette plot viser sammenligning af egnethed spirende gær deletioner (yfgΔ) kombineret med den neutrale ura3Δ mutation eller temperaturfølsomme CDC13-1 mutation og dyrket på semi-tilladelige temperatur for CDC13- 1 (27 ° C). Fitness blev beregnet som produktet af den maksimale fordobling procentsatsen og det maksimale fordobling potentiale 1. De fleste deletionsstammer vokser godt, når de kombineres med den neutrale ura3Δ mutation, som forventet, og har høj formen men deletioner kombineret med CDC13-1 har en bred vifte af fitnesses. De lyseblå linier krydser på the placering af den neutrale his3Δ mutationen, den fuldt optrukne linie er en lineær regressionsanalyse af den genetiske uafhængighed (forventet egnethed CDC13-1 yfgΔ mutanter viste egnethed ura3Δ yfgΔ mutanter) og den stiplede linie er den linie lige form. Sletninger farvet grøn i høj grad styrke egnethed defekt i CDC13-1 stammer. Sletninger farvet rød betydeligt undertrykker den samme defekt. Lodret afstand af en mutation CDC13-1 yfgΔ fra den fuldt optrukne linie angiver styrken af genetiske interaktion mellem CDC13-1 og yfgΔ under pladen betingelser. Bemærk, at nogle af de stærkeste suppressorer af CDC13-1 som tidligere er identificeret checkpoint gener, RAD17, DDC1 og RAD24 og nuklease EXO1 øverst til højre. Gener, hvis sletning reducerer fitness omfatter YKU80 (koder for DNA-reparation og telomer capping protein YKU80) nær<html> nederst til højre. Bemærk også, at nogle grupper af gener, der fungerer sammen en tendens til at blive placeret på dette plot. Tre eksempel klynger er fremhævet med blåt SPE1, SPE2 og SPE3: spermidin syntese gener, RAD17 og DDC1 og RAD24: kodning komponenter i Checkpoint glidende klemme og checkpoint klemme loader, MRE11, RAD50 og XRS2: den MRX kompleks, der er involveret i DDR og EST1 &amp; EST3: gener involveret i telomerlængde regulering. Tilpasset fra Supplerende figur 1B 1, kan rådata hvorfra dette plot blev genereret hentes her: <a href="http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/" target="_blank">http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/</a> . <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig4.pdf" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . &quot;&gt; <tbody><tr><td> Fil-id </td><td> File Type </td><td> Manuelt Konstrueret </td><td> Opdater Frekvens </td><td> Forudsætning </td></tr><tr><td> FT1 </td><td> Plate fotografi </td><td> Ingen </td><td> Per plade og tidspunkterne </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT2 </td><td> Eksperimentel Beskrivelse </td><td> Ja </td><td> Per eksperiment </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT3 </td><td> Bibliotek Beskrivelse </td><td> Ja </td><td> Per bibliotek </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT4 </td><td> Standard Gene Navne </td><td> Ja </td><td> Per bibliotek </td><td> Ingen </td></tr><tr><td> FT5 </td><td> Colonyzer Udsend </td><td> Ingen </td><td> Per tidspunkterne per plade </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT6 </td><td> QFA Rådata </td><td> Ingen </td><td> Per eksperiment </td><td> - </td></tr><tr><td> FT7 </td><tD&gt; QFA Logistic parametre </td><td> Ingen </td><td> Per eksperiment </td><td> - </td></tr><tr><td> FT8 </td><td> QFA Fitness Oversigt </td><td> Ingen </td><td> Per eksperiment </td><td> - </td></tr><tr><td> FT9 </td><td> QFA Genetisk Interaktion hitlisten </td><td> Ingen </td><td> Per GIS undersøgelse (2 expts.) </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Elektroniske QFA filer. Alle de anførte filer (bortset fra FT1) er tabulatorseparerede tekstfiler og kan konstrueres eller læses ved hjælp af en teksteditor eller regneark. For yderligere oplysninger om at opbygge QFA metadata filer og præcise fortolkning af QFA output se QFA R pakken dokumentation 7 og Colonyzer softwaredokumentationen 3. <img src="/files/ftp_upload/4018/4018table2.jpg" alt="Tabel 2" /> Tabel 2 nedenfor. Metoder til vurdering kultur fitness. En sammenfatning af funktioner og krævermenter i en række metoder til vurdering af mikrobielle kultur fitness. En gennemgang af Blomberg 8 indeholder en mere detaljeret sammenligning af nogle af disse. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018table2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> .

<ol>
	<li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects.">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362 (2011).</li><li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li><li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonyzer:+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar.">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li><li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping.">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li><li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70&#916;mutants.">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70&#916;mutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li><li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li><li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li><li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries.">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864 (2011).</li><li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants.">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li><li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+ecology:+The+social+side+of+wild+yeast.">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

QFA er på mange måder en direkte efterkommer af tre etablerede bench-skala mikrobiologiske teknikker: kultur fortyndingsrække stikprøver 9, vækstkurven bestemmelse i vand tilsat flydende kulturer 9 og replikaudpladning 13. Disse tre fremgangsmåder er opsummeret og sammenlignet med QFA og andre højt gennemløb teknikker i tabel 2. Ud fra følgende betragtninger fortyndingsrække stikprøver definerer en stamme egnethed som sin evne til at danne kolonier i en serie af kulturer dyrket fra en række af inokulum fortyndinger, at QFA foranstaltninger belastning fitness ved gentagne observationer af en enkelt kultur konstruere en vækstkurve. Kvantificering fitness fra enkelte kulturer giver mange flere stammer, der skal undersøges samtidigt, under identiske betingelser. Replikerende arrays af kulturer tillader gentagne test af stamme samlinger, mest nyttig ved test for kultur fitness forskelle i forskellige miljøer eller genetiske baggrunde. Den QFA protokol præsenteretHer anvender kostbart robotudstyr til at replikere, inokulere, inkuberes og billeddata agarplader, passende for at observere vækst af tusinder af uafhængige kulturer (robot QFA, tabel 2). Men da QFA bygger på etablerede, traditionelle laboratorieteknikker, kan det også udføres langt billigere ved at erstatte robot bistand i forbindelse med manuelle trin (manuel QFA, tabel 2). Manuel QFA indebærer replikation og podning af kulturer på agarplader ved hjælp af en manuel pin værktøj og manuel overførsel af plader til og fra en inkubator til fotografering. Den samme Computeranalyse arbejdsgang kan anvendes til at generere vækstkurverne fra begge eksperimentelle design. QFA fitness estimater synes at være forholdsvis præcist. I figur 4 er de gennemsnitlige fitnesses fire eksempel klynger af funktionelt beslægtede gendeletioner fremhævet. Nærheden af ​​medlemmer af hvert funktionelt relateret gen klasse i to uafskellige genetiske baggrunde (ura3Δ og CDC13-1) angiver reproducerbarheden af QFA fitness skøn. For eksempel adskiller kun 3 gendeletioner (ud af en mulig 4300) tre medlemmer af den konserverede MRX komplekset. High-throughput alternativer til QFA for afprøvning vækstkarakteristika af mikrobielle stammer indbefatter SGA 5,6, konkurrence skærme i stregkodede biblioteker 11,12 og skærme indfangningsproceduren optiske densitet kinetik i spektrofotometriske plade læser 10, der er opsummeret i tabel 2 og er beskrevet mere fuldstændigt andetsteds 8 . QFA og SGA plader, hvor kulturer vokser på fast agar overflader (agar-baserede metoder, tabel 2) kan håndteres hurtigt og nemt med robot. Solid agaroverfladen kulturer er godt beluftet hele vækst og celler kan vokse i faste kulturer, så omgængelig mikrober til at vokse i et fællesskab 14. Efterlades intakt, mikrobielle samfund etffect deres mikromiljøer og secernerer toksiner såsom ethanol, og eventuelt signalering mellem celler. Men kontinuerlig blanding af flydende kulturer, der er nødvendige for at opnå tilstrækkelig beluftning, kunstigt forstyrrer mikrobielle samfund og deres mikro-miljøer, som kan påvirke deres former for vækst. Krydskontaminering er et mindre problem i fast agar metoder, da der er mindre mulighed for væskesprøjt bærende celler mellem kulturer. Hvis kontaminering forekommer ved fremmede luftbårne mikroorganismer i fast agar-assays, kan det ofte kan detekteres ved visuel inspektion af faste agarplader og udgjorde eller fjernes. QFA gennemløb er betydeligt højere end parallelle flydende metoder på to måder. Først og fremmest, om QFA (og SGA) plader, der er podede kulturer pakkes sammen mere tæt, hvilket giver flere uafhængige kulturer per plade. I QFA er der typisk 308 kulturer, ikke tælle ikke-eksperimentelle kant kulturer (fig. 1) KOMforhold til parallelt flydende kulturer med 96 eller 100 kulturer per plade. For det andet kan QFA eksperimenter skaleres til en meget større antal plader. Medens antallet af plader blev analyseret i et enkelt QFA eksperiment er kun begrænset af den tilgængelige plads i en inkubator eller varmt rum, den mindste tilladelige billedoptagelse frekvens og den maksimalt opnåelige indfangning frekvens, antallet af plader i en væske vækst eksperiment er stærkt begrænset ved evnen af ​​pladelæser (typisk en eller to plader), eller af stabler fastgjort til pladelæser (typisk 25-50 plader). Vi har for nylig gennemført en fuldt automatiseret QFA eksperiment på 123 plader, hver med 308 eksperimentelle kulturer, hvilket giver 37,884 samtidige kulturer. Vi vurderer, at det maksimalt opnåelige antal selvstændige kulturer, der vokser i væsken er 96 (kulturer / plade) x 50 (plader / stabler) = 4800, hvilket er omkring ti gange mindre end vores QFA gennemløb. En alternativ til flydende kultur skærme er at anvende mange automatiserede groWth enheder parallelt (tabel 1 fra gennemgangen af Blomberg 8), der hver har en kapacitet på en eller to plader. Temperatur kontrol i hver enhed er uafhængig, og det forhold er ikke identiske, men forudsat at de er, ville denne arbejdsproces kræver mindst 190 sådanne anordninger til at matche QFA gennemløb (under forudsætning af 200 flydende kulturer pr enhed). Sammenfattende er QFA en høj kvalitet arbejdsgang, der med fordel kan anvendes til at indsamle kvantitative vækst fænotyper i både små skala fokuserede eksperimenter og high-throughput skærme. Den er fleksibel nok til at blive anvendt effektivt med varierende krav til robotudstyr. Den beregningsmæssige del af QFA arbejdsgangen er baseret på frit tilgængelige, open source-kode.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens / udstyr </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> 96 stift manuel pintool med 1/8 &quot;diameter tappe </td></tr><tr><td> Bland Mate </td><td> Eppendorf </td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td> Beckman </td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td> Thermo Scientific </td><td> 50095890 </td><td> Installeret på Biomek FX </td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> BM3-SC </td><td> 192 hylde roterende karrusel </td></tr><tr><td> spImager </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> spImager </td><td> Høj opløsning manuel billedbehandling </td></tr><tr><td> spImager med Cytompå </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Brugerdefineret </td><td> Temperatur styres automatiseret høj opløsning billeddannelse </td></tr><tr><td> Cytomat 6001 med varmeveksler </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51022222 </td><td> Knyttet til spImager </td></tr><tr><td> Ecoline RE207 </td><td> Lauda </td><td> RE207 </td><td> Knyttet til Cytomat </td></tr><tr><td> spImager med karrusel </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Brugerdefineret </td><td> Automatiseret høj opløsning billeddannelse </td></tr><tr><td> Robotten pin værktøj fikstur til FP12pins </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 x FP12 ben </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> FP12 </td><td> 50,4 mm lang, 17 mm udsættes stift længde </td></tr><tr><td> Docking Station for Pin Tool </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP425 </td><td> Docking station basen fjernet for at tillade fan tørring af stifter </td></tr><tr><td>Pin Rensebørste </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> Manuel pin værktøj </td></tr><tr><td> Nunc OmniTray med låg </td><td> Nunc </td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 og sterile polystyrenplader </td><td> Greiner BioOne </td><td> 655161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 og sterile polystyren låg </td><td> Greiner BioOne </td><td> 656171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Specifikke reagenser og udstyr.

a quantitative fitness analysis workflow

Kvantitative Fitness Analyse (QFA) er en eksperimenterende og beregningsmæssige workflow til at sammenligne fitnesses af mikrobielle kulturer dyrket i parallel 1,2,3,4. QFA kan anvendes til fokuserede observationer af enkelte kulturer, men er mest nyttig for genom-dækkende genetiske interaktion eller narkotika skærme undersøge op til tusindvis af uafhængige kulturer. Den centrale eksperimentelle fremgangsmåde er inokulering af uafhængige, fortyndede flydende mikrobielle kulturer på faste agarplader, som blev inkuberet og regelmæssigt fotograferet. Billeder fra hvert tidspunkt analyseres, producerer kvantitative celledensitet estimater, som anvendes til at konstruere vækstkurver, så kvantitative fitness der skal udledes. Kultur fitnesses kan sammenlignes med kvantificere og rangordne genetiske interaktion styrker eller narkotika følsomhed. Effekten på kultur egnethed af eventuelle behandlinger tilføjet i underlaget agar (fx små molekyler, antibiotika eller næringsstoffer) eller anvendes på plader eksternly (f.eks UV-bestråling, temperatur) kan kvantificeres ved QFA. Den QFA arbejdsgang fremstiller væksthastighed anslår analoge til dem opnået ved spektrofotometrisk måling af parallelle flydende kulturer i 96-brønds eller 200-brøndplade læsere. Vigtigt, QFA har signifikant højere gennemløb sammenlignet med sådanne fremgangsmåder. QFA kulturer vokse på en fast agaroverfladen og er derfor godt beluftet under vækst uden behov for omrøring eller omrystning. QFA throughput er ikke så høj som for nogle syntetiske Genetisk Array (SGA) screeningsmetoder 5,6. Men da QFA kulturer er stærkt fortyndet, før de podet på agar, kan QFA fange mere komplette vækstkurver, herunder eksponentiel og farvemætning fase 3. For eksempel giver vækstkurven observationer kultur fordoblingstider skal estimeres direkte med høj præcision, som diskuteret tidligere 1. Her præsenterer vi enspecifik QFA protokol anvendes til tusindvis af S. cerevisiae kulturer, der håndteres automatisk af robotter i løbet af podning, inkubation og billedbehandling. Enhver af disse automatiserede trin kan erstattes af en tilsvarende, manuel procedure, med en tilhørende reduktion i gennemløb, og vi også præsentere en lavere overførselshastighed manuel protokol. De samme QFA softwareværktøjer kan anvendes på billeder taget i enten arbejdsgang. Vi har stor erfaring gælder QFA til kulturer af den spirende gær S. cerevisiae, men vi forventer, at QFA vil vise sig lige så nyttig for behandlingen kulturer fission gær S. pombe og bakteriekulturer.

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fitness Analysis Workflow at JoVE.com

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Kvantitative Fitness Analyse (QFA) er en supplerende serie af eksperimentelle og beregningsmæssige metoder til estimering af mikrobielle kultur fitnesses. QFA estimerer effekten af ​​genetiske mutationer, lægemidler eller andre anvendte behandlinger for mikrobe vækst. Forsøgene skalering af fokuserede analyse af enkelte kulturer til tusindvis af parallelle kulturer kan udformes.

En kvantitativ Fitness Analyse Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Kvantitative levende celler fluorescens-mikroskopi Analyse af Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Kvantitativ analyse af Random migration af celler Brug af Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Kvantitativ analyse af Autophagy hjælp Advanced 3D fluorescensmikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

En High Throughput MHC II Bindende Assay til kvantitativ analyse af peptidepitoper

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

En ny teknik til kvantitativ analyse af hårtab i mus Brug gråtoner Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Komplet Workflow for Analyse af Histon post-translationelle modifikationer Brug Bottom-up-massespektrometri: Fra Histon Extraction til dataanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.