Name: a quantitative fitness analysis workflow
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00
Duration: 11 min 39 s
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Ringraziamo tutti i membri del nostro laboratorio e del Centro per la Biologia Sistema Integrato di Invecchiamento e Nutrizione (CISBAN) per il supporto e le discussioni utili. Questo studio è stato supportato da biotecnologia e Biological Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) e il Wellcome Trust (075.294, 093.088).

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	<li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects.">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362 (2011).</li><li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li><li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonyzer:+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar.">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li><li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping.">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li><li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70&#916;mutants.">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70&#916;mutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li><li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li><li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li><li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries.">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864 (2011).</li><li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants.">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li><li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+ecology:+The+social+side+of+wild+yeast.">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

QFA è in molti sensi una diretta discendente di tre stabiliti banco scala tecniche microbiologiche: la cultura del test di diluizione in loco della serie 9, la determinazione della curva di crescita in colture liquide gassose 9 e placcatura replica 13. Questi tre metodi sono riassunte e confrontati con QFA ed altre tecniche ad alta produttività in Tabella 2. Considerando che la diluizione, saggi punti in serie di definire un ceppo di idoneità come la sua capacità di formare colonie in una serie di colture derivate da una serie di diluizioni di inoculo, QFA fitness ceppo misure con osservazioni ripetute di una singola cultura per costruire una curva di crescita. Quantificare il fitness da singole culture permette di molti ceppi di più per essere esaminate simultaneamente, in condizioni identiche. Replica di array di culture permette ripetute prove su collezioni estensimetri, più utile quando si verifica per le differenze culturali di fitness in ambienti diversi o sfondi genetici. Il protocollo QFA presentatoqui usa costose attrezzature robotiche di replicare, inoculare, incubare le piastre di agar e di immagini, adatto per osservare la crescita di migliaia di culture indipendenti (robotica QFA, Tabella 2). Tuttavia, poiché QFA si basa su consolidati, tradizionali tecniche di laboratorio, può anche essere effettuata molto più basso sostituendo assistenza robot con operazioni manuali (manuale QFA, Tabella 2). Manuale QFA coinvolge la replicazione e inoculo delle colture su piastre di agar con uno strumento manuale pin e il trasferimento manuale dei piatti da e per un incubatore per la fotografia. Lo stesso flusso di analisi computazionale può essere applicata per generare curve di crescita di entrambi disegno sperimentale. QFA stime fitness sembrano essere relativamente preciso. In figura 4, le convenienze medi di quattro gruppi di esempio funzionalmente delezioni di geni correlati sono evidenziati. La vicinanza dei membri di ciascuna classe funzionale gene correlato in due indisfondi ent genetiche ura3Δ e CDC13-1) indica la riproducibilità dei QFA stime fitness. Ad esempio, solo 3 delezioni geniche (su un massimo di 4.300) separare i tre membri del complesso MRX conservato. Throughput elevato alternative QFA per testare le caratteristiche di crescita di ceppi microbici includono SGA 5,6, schermi concorrenza librerie a barre 11,12 e schermi cattura cinetica densità ottica in lettori di piastre spettrofotometrici 10 che sono riassunti nella Tabella 2 e descritto più dettagliatamente altrove 8 . QFA e piastre SGA, in cui le culture crescono su superfici solide (agar agar metodi basati, Tabella 2) possono essere gestite in modo rapido e facilmente robot. Solid culture superficie dell&#39;agar sono ben aerati in tutta la crescita e le cellule possono crescere in colture fisse, consentendo microbi socievoli di crescere in una comunità 14. Lasciato intatto, una comunità microbicheffect proprie micro-ambienti, tossine secernono come etanolo, ed eventualmente di segnalazione tra cellule. Tuttavia, continua mescolanza di culture liquidi, necessari per raggiungere una adeguata aerazione, artificialmente sconvolge le comunità microbiche e le loro micro-ambienti che possano pregiudicare il loro modalità di crescita. Cross-contaminazione è meno di una preoccupazione nei metodi di agar solido poiché non vi è meno possibilità di schizzi di liquidi tra le cellule che trasportano le culture. Se la contaminazione avviene per stranieri aerodispersi microbi nei saggi agar solido, spesso può essere rilevata mediante ispezione visiva delle piastre di agar solido e contabilizzati o rimosso. Velocità QFA è significativamente superiore a quello dei metodi parallele liquido in due modi. Prima di tutto, e il QFA (SGA), piatti, colture inoculate sono imballate insieme più densamente, dando culture più indipendenti per piastra. In QFA ci sono culture in genere 308, senza contare le culture non-sperimentali bordo (Figura 1) COMconfrontato in parallelo colture liquide con 96 o 100 culture per piastra. In secondo luogo, gli esperimenti QFA può essere scalata a un numero maggiore di piastre. Considerando che il numero di piastre analizzati in un singolo esperimento QFA è limitato soltanto dallo spazio disponibile in una stanza incubatore o calda, la frequenza minima consentita l&#39;acquisizione di immagini e la frequenza massima di acquisizione ottenibile, il numero di piastre in un esperimento crescita liquido è fortemente limitata dalla capacità del lettore di piastre (tipicamente uno o due piastre), o del raccoglitore collegato al lettore di piastre (normalmente 25-50 piastre). Abbiamo recentemente effettuato un esperimento completamente automatizzato QFA su 123 piastre, ciascuna con 308 culture sperimentali, dando 37,884 culture contemporanee. Stimiamo che il numero massimo raggiungibile di culture indipendenti che crescono in liquido è 96 (culture / piastra) x 50 (piastre / raccoglitore) = 4800, che è di circa dieci volte inferiore rispetto alla nostra velocità QFA. Un&#39;alternativa per schermi coltura liquidi è quello di utilizzare molti gro automatizzatowth dispositivi in parallelo (tabella 1 dal recensione di Blomberg 8), ciascuno avente una capacità di una o due piastre. Il controllo della temperatura in ogni dispositivo è indipendente, e quindi le condizioni non sono identici, ma assumendo che siano, questo flusso di lavoro richiederebbe almeno 190 di tali dispositivi in ​​modo che corrisponda il throughput QFA (assumendo 200 colture liquide per dispositivo). In sintesi, QFA è un flusso di lavoro di alta qualità che può essere utilmente applicato per raccogliere fenotipi crescita quantitativa sia in piccoli esperimenti su scala mirati e high-throughput schermi. E &#39;sufficientemente flessibile per essere applicato efficacemente con diversi requisiti per le apparecchiature robotica. La componente di calcolo del flusso di lavoro si basa su QFA liberamente disponibile, il codice open source.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> 96 pin manuale pintool con 1/8 pin diametro &quot; </td></tr><tr><td> Mescolare Mate </td><td> Eppendorf </td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td> Beckman </td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td> Thermo Scientific </td><td> 50095890 </td><td> Installato su Biomek FX </td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> BM3-SC </td><td> 192 ripiano giostra rotante </td></tr><tr><td> spImager </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> spImager </td><td> Manuale di imaging ad alta risoluzione </td></tr><tr><td> spImager con Cytoma </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Costume </td><td> Temperatura controllata automatizzato di imaging ad alta risoluzione </td></tr><tr><td> Cytomat 6001 con scambiatore di calore </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51022222 </td><td> Collegato al spImager </td></tr><tr><td> Ecoline RE207 </td><td> Lauda </td><td> RE207 </td><td> Collegato al Cytomat </td></tr><tr><td> spImager con il carosello </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Costume </td><td> Automated imaging ad alta risoluzione </td></tr><tr><td> Robot strumento dispositivo pin per FP12pins </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 x FP12 pin </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> FP12 </td><td> 50,4 mm di lunghezza, 17 mm di lunghezza esposto pin </td></tr><tr><td> Docking Station per lo strumento di Pin </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP425 </td><td> Base docking station rimosso per consentire l&#39;essiccazione fan dei perni </td></tr><tr><td>Pin Spazzola di pulizia </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> Pin utensile manuale </td></tr><tr><td> Nunc OmniTray con coperchio </td><td> Nunc </td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 piastre di polistirene e sterili </td><td> Greiner BioOne </td><td> 655161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 coperchi in polistirene e sterili </td><td> Greiner BioOne </td><td> 656171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Reagenti e attrezzature specifiche.

a quantitative fitness analysis workflow

Fitness Quantitative Analysis (QFA) è un flusso di lavoro sperimentale e computazionale per confrontare convenienze delle colture microbiche cresciute in parallelo 1,2,3,4. QFA può essere applicato alle osservazioni focalizzate su singole culture, ma è molto utile per genome-wide interazione genetica o studiando schermi di droga fino a migliaia di culture indipendenti. Il metodo sperimentale è centrale l&#39;inoculazione di indipendenti, diluiti colture liquide microbiche su piastre di agar solido che vengono incubate e regolarmente fotografato. Fotografie di ciascun punto temporale vengono analizzati, producendo quantitativi stime di densità cellulari, che vengono utilizzati per costruire curve di crescita, consentendo misure quantitative di fitness da derivati. Convenienze della cultura può essere paragonato a quantificare e classificare i punti di forza di interazione genetica o sensibilità di droga. L&#39;effetto sul fitness cultura di eventuali trattamenti aggiunto in agar substrato (ad esempio piccole molecole, antibiotici o sostanze nutritive), ovvero applicati alle piastre esternely (ad esempio irradiazione UV, temperatura) può essere quantificato QFA. Il flusso di lavoro QFA produce crescita stime analoghi a quelli ottenuti mediante misurazione spettrofotometrica della paralleli colture liquide in lettori di piastre da 96 pozzetti o 200-bene. È importante sottolineare che, QFA ha un throughput significativamente più alto rispetto a tali metodi. Culture QFA crescere su una superficie solida agar e sono pertanto ben aerato durante la crescita senza la necessità di mescolamento o agitazione. Il throughput QFA non è così elevata come quella di alcuni Array sintetico genetica (SGA) metodi di screening 5,6. Tuttavia, poiché le culture QFA sono fortemente diluiti prima di essere inoculato su agar, QFA in grado di catturare le curve di crescita più complete, tra cui esponenziale e le fasi di saturazione 3. Ad esempio, le osservazioni curva di crescita consentire tempi di duplicazione di coltura per stimare direttamente con elevata precisione, come discusso in precedenza 1. Qui vi presentiamo unospecifico protocollo QFA applicata a migliaia di S. cerevisiae culture che vengono automaticamente gestite da robot durante l &#39;inoculazione, incubazione e di imaging. Qualsiasi di queste fasi automatizzate può essere sostituito da un equivalente, procedura manuale, con associata una riduzione nella velocità, e si presentano anche un protocollo inferiore manuale velocità. Gli stessi strumenti software QFA possono essere applicati alle immagini catturate in entrambi flusso di lavoro. Abbiamo una vasta esperienza applicando QFA alle culture del lievito nascente S. cerevisiae ma ci aspettiamo che QFA si rivelerà altrettanto utile per l&#39;esame delle culture del lievito di fissione S. pombe e culture batteriche.

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A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Fitness Quantitative Analysis (QFA) è una serie complementare di metodi sperimentali e computazionali per la stima convenienze coltura microbica. QFA stima l&#39;effetto di mutazioni genetiche, farmaci o altri trattamenti applicati sulla crescita microbica. Esperimenti di scala dall&#39;analisi focalizzata di singole culture a migliaia di colture in parallelo possono essere progettati.

A Quantitative Analysis Fitness Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

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