Name: a quantitative fitness analysis workflow
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00
Duration: 11 min 39 s
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我々は感謝して我々の研究室とサポートと有益な議論のための高齢化と栄養（CISBAN）の統合システム生物学センターのすべてのメンバーを承認します。本研究では、バイオテクノロジー·生物科学研究会議（BBSRC）（BB/C008200/1）やウェルカム·トラスト（075294、093088）によりサポートされていました。

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	<li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects.">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362 (2011).</li><li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li><li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonyzer:+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar.">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li><li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping.">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li><li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70&#916;mutants.">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70&#916;mutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li><li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li><li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li><li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries.">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864 (2011).</li><li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants.">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li><li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+ecology:+The+social+side+of+wild+yeast.">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

文化の希釈系列のスポットテスト9、通気液体培養9およびレプリカ平板13の成長曲線の決定：QFAは、多くの感覚に3つの確立されたベンチスケールの微生物学的技術の直接の子孫である。これらの3つの方法は、要約し、QFA及び表2の他のハイスループット技術と比較されます。希釈系列のスポットテストでは、接種希釈の範囲から成長した文化のシリーズのコロニーを形成する能力とひずみの適合性を定義するのに対し、単一文化の繰り返し観測によるQFA対策ひずみフィットネスは、成長曲線を構築する。単一文化の適合性を定量化すると、より多くの株が同一の条件下では、同時に検査することができます。異なる環境や遺伝的背景の培養フィットネスの違いをテストするときに文化の複製配列は、最も有用菌株コレクションの繰り返しテストすることができます。 QFAプロトコルは、提示ここで、独立した文化（ロボットQFA、 表2）数千人の成長を観察するための適切なインキュベーションとイメージ寒天プレートを複製接種するために高価なロボット装置を使用しています。 QFAが確立し、伝統的なラボの技術に基づいているので、しかし、それはまた、手動の手順（マニュアルQFA、 表2）ロボットの援助を置き換えることによって、はるかに安価に行うことができます。マニュアルQFAは、手動でピンツールとおよび写真撮影のためのインキュベーターからプレートの手動転送を使用して、寒天プレート上に培養物の複製および接種が含まれます。同じ計算解析ワークフローのいずれか実験的なデザインから成長曲線を生成するために適用することができます。 QFAフィットネスの見積もりが比較的正確であるように見える。 図4では、機能的に関連する遺伝子欠失の4例では、クラスタの平均適応度が強調表示されます。 2の自主的にそれぞれの機能的関連遺伝子クラスのメンバーの近接ENT遺伝的背景は、（ura3ΔとCDCl 3-1）QFAフィットネス推定値の再現性を示しています。たとえば、わずか3遺伝子欠失（アウト可能な4300の）保存されたMRX複合体の3つのメンバーを分離します。 微生物株の増殖特性をテストするためのQFAに高スループットの選択肢がバーコードライブラリ11,12および他のより完全に8を 表2にまとめて記載されている分光光度プレートリーダー10の光学濃度の動態をキャプチャ画面でSGA 5,6、競争画面を含む。培養は固体培地の表面上に成長QFAとSGAプレート（寒天ベースの方法、 表2）ロボットが迅速かつ容易に処理することができます。固体寒天表面の文化はよく成長全体に通気されており、細胞は社交的な微生物がコミュニティ14に成長することができ、固定の文化で成長することができます。左そのまま、微生物群集独自のマイクロ環境では、エタノールなどを分泌する毒素をffect、おそらく細胞間シグナル伝達。しかし、十分な通気を達成するために必要な、液体培養の連続混合、人工的に成長のそのモードに影響を与える可能性微生物群集とその微小環境を破壊する。文化間の細胞を運ぶ液体の飛沫の少ないチャンスがあるので、クロスコンタミネーションは、固形寒天方法の懸念が少ないです。汚染が固体寒天アッセイにおける外国空気を媒介とする微生物によって発生した場合、それはしばしば固体寒天プレートの目視検査によって検出され、占めまたは削除することができます。 QFAのスループットは、2つの方法で並列液体の方法に比べて有意に高くなっています。まず第一に、QFA（およびSGA）プレート上に接種した培養物は、プレート当たり複数の独立した文化を与え、より密に一緒にパックされています。 QFAで308の文化は、非実験的なエッジの培養（ 図1）COMはカウントしません、一般的に存在するプレート96または100文化と液体培養を並列に比較されます。第二に、QFA実験は、プレートのはるかに大きな数に拡張することができます。シングルQFA実験で分析したプレートの数は、インキュベーターまたは暖かい部屋、最小許容画像キャプチャの周波数と達成可能な最大キャプチャ周波数で使用可能なスペースによって制限される一方、液体増殖実験ではプレートの数を強く制限されているプレートリーダー（通常は1つまたは2つのプレート）、またはプレートリーダー（通常は25から50プレート）に接続されているスタッカの容量による。我々は最近、37884同時の文化を与え、123プレート、308実験的な文化とそれぞれの完全に自動化されたQFA実験を行った。我々は、液体中で成長して独立した文化の達成可能な最大数は96（文化/プレート）×50（プレート/スタッカ）私たちのQFAのスループットに比べ約10倍未満である= 4800であると推定している。液体培養の画面の代わりに、多くの自動化されたGROを利用することである並行してWTHデバイス（Blombergの8による評価から表1）、1つまたは2つのプレートの容量を持っている各。各デバイスの温度制御は独立している、などの条件が同一ではありませんが、あると仮定し、このワークフローでは、少なくとも190のようなデバイスは、QFAのスループットを（デバイスあたり200液体培養と仮定して）一致するように必要になります。 要約すると、QFAは有用小規模焦点を当てた実験や、高スループットのスクリーンの両方で、量的成長の表現型を収集するために適用することができ、高品質なワークフローです。それは、ロボット装置の要件を変えることで効果的に適用されるのに十分な柔軟性があります。 QFAワークフローの計算コンポーネントは、自由に利用できる、オープンソースコードに基づいています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/装置の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>レプリカプラター</td><td>シグマ</td><td> R-2508 </td><td> 1/8 &quot;径のピンと96ピンマニュアルpintool </td></tr><tr><td>ミックスメイト</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td>ベックマン</td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 50095890 </td><td> Biomek FXにインストールされている</td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S＆Pロボット株式会社</td><td> BM3-SC </td><td> 192棚回転カルーセル</td></tr><tr><td> spImager </td><td> S＆Pロボット株式会社</td><td> spImager </td><td>高解像度マニュアルイメージング</td></tr><tr><td> CytomとspImagerに</td><td> S＆Pロボット株式会社</td><td>カスタム</td><td>温度が自動化された高分解能イメージングを制御</td></tr><tr><td>熱交換器とCytomat 6001 </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 51022222 </td><td> spImagerに接続されている</td></tr><tr><td> ECOLINE RE207 </td><td>ラウダ</td><td> RE207 </td><td> Cytomatに接続されている</td></tr><tr><td>カルーセルとspImager </td><td> S＆Pロボット株式会社</td><td>カスタム</td><td>自動化された高分解能イメージング</td></tr><tr><td> FP12pinsのロボットピンツールフィクスチャ</td><td> V＆Pサイエンティフィック</td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96×FP12ピン</td><td> V＆Pサイエンティフィック</td><td> FP12 </td><td>長い50.4ミリメートル、17ミリメートル露出したピンの長さ</td></tr><tr><td>ピンツールのドッキングステーション</td><td> V＆Pサイエンティフィック</td><td> VP425 </td><td>ドッキングステーションベースはピンのファンの乾燥を可能にするために除去</td></tr><tr><td>ピンのクリーニングブラシ</td><td> V＆Pサイエンティフィック</td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td>レプリカプラター</td><td>シグマ</td><td> R-2508 </td><td>マニュアルのピンツール</td></tr><tr><td>蓋ヌンクOmniTray </td><td>ヌンク</td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96ウェル滅菌ポリスチレンプレート</td><td>グライナーBioOne </td><td> 655161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96ウェル滅菌ポリスチレン蓋</td><td>グライナーBioOne </td><td> 656171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> 表3。特異的試薬および装置。

a quantitative fitness analysis workflow

定量的なフィットネスの分析（QFA）は、並列1,2,3,4で育った微生物培養の適応度を比較するための実験と計算のワークフローです。 QFAは、単一の文化の焦点を絞っ観測に適用されるが、独立した文化の数千までの調査のゲノムワイドな遺伝的相互作用や薬物スクリーンのための最も有用であることができます。中央の実験方法では、インキュベートし、定期的に撮影されている固体寒天プレート上に独立した、希釈液を微生物培養の接種です。各時間ポイントからの写真は、定量的なフィットネスの措置が導出できるようになり、成長曲線を構築するために使用されている定量的な細胞密度の見積もりを、製造、分析されます。文化適応度は遺伝的相互作用の強さや薬剤感受性を定量化し、ランク付けするのに比較することができます。すべての治療の培養適応に与える影響は、基板の寒天（例えば、小分子、抗生物質や栄養素）に追加したり、外部のプレートに適用LY（例えばUV照射、温度）がQFAによって定量化することができます。 QFAワークフローでは、成長率は96ウェルまたは200ウェルプレートリーダーで並列液体培養の分光光度測定により得られるものに類似して推定し生成します。重要なのは、QFAは、このような方法と比較して有意に高いスループットを持っています。 QFA培養は固体培地の表面に成長するので、よく撹拌又は振盪を必要とせず、成長中に通気されています。 QFAのスループットは、いくつかの合成遺伝子アレイ（SGA）のスクリーニング方法5,6のそれと同じくらい高くはありません。 QFAの文化が頻繁に寒天に接種される前に希釈されているのでしかし、QFAは3指数と彩度の段階を含む、より完全な成長曲線を、キャプチャすることができます。たとえば、成長曲線の観測は、以前は1説明したように文化の倍加時間は、高精度を直接推定することができます。 ここでは提示S.数千人に適用される特定のQFAプロトコル自動的に接種、培養し、撮像中にロボットによって処理される酵母の培養。これらの自動化のいずれかの手順は、スループットに関連して減少し、同等の、マニュアルの手順に置き換えられ、我々はまた、低いスループット·マニュアル·プロトコルを提示することができます。同じQFAソフトウェアツールのいずれかのワークフローで撮影した画像に適用することができます。 私たちは出芽酵母の培養にQFAを適用する豊富な経験を持っているS.酵母しかし、我々はQFAは分裂酵母S.の文化を調べるために均等に役立つことを期待酵母と細菌培養。

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A Quantitative Fitness Analysis Workflow

定量的なフィットネスの分析（QFA）は、微生物の培養適応度を推定するための実験と計算手法の相補的なシリーズです。 QFAは、遺伝的変異、薬剤や微生物の成長の他の適用された治療の効果を推定します。単一の文化の焦点を絞っ分析から並列文化の何千もの実験のスケーリングを設計することができる。

定量的なフィットネスの分析ワークフロー

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Research

JoVE Journal

Biology

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ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ

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