Name: a quantitative fitness analysis workflow
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00
Duration: 11 min 39 s
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우리는 기꺼이 우리의 연구실과 기술 지원 및 도움 토론 고령화와 영양 (CISBAN)의 통합 시스템 생물학을위한 센터의 모든 구성원을 인정합니다. 이 연구는 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회 (BBSRC) (BB/C008200/1)와 Wellcome 트러스트 (075,294, 093,088)에 의해 지원되었다.

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	<li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects.">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362 (2011).</li><li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li><li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonyzer:+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar.">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li><li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping.">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li><li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70&#916;mutants.">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70&#916;mutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li><li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li><li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li><li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries.">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864 (2011).</li><li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants.">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li><li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+ecology:+The+social+side+of+wild+yeast.">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

QFA은 여러 감각에 직접 셋 설립 벤치 규모의 미생물 기술의 후손 : 문화 희석 시리즈 스포트 테스트 9 aerated 액체 문화 9, 복제 도금 13 성장 곡선 결정. 이러한 세 가지 방법을 요약하고 QFA 및 표 2에있는 다른 높은 처리량 기법과 비교됩니다. 희석 시리즈 스폿 테스트 inoculum의 dilutions의 범위에서 성장 문화 일련의 식​​민지를 형성하는 기능으로 변형의 적합성을 정의하는 반면, 단일 문화의 반복 관측에 의한 QFA 측정 스트레인 헬스는 성장 곡선을 만들 수 있습니다. 단일 문화권에서 체력을 Quantifying 것은 더 많은 변종이 동일한 조건 하에서, 동시에 검사 할 수 있습니다. 다른 환경이나 유전적 배경에있는 문화 운동의 차이에 대해 테스트할 때 문화의 복제 배열은 대부분의 유용 스트레인 컬렉션의 반복 테스트를하실 수 있습니다. QFA 프로토콜 제공여기에, 독립적인 문화 (로봇 QFA, 표 2) 수천의 성장을 관찰 적합한 부화 및 이미지 한천 플레이트를 복제 예방하기 위해 고가의 로봇 장비를 사용합니다. QFA가 설립, 전통적인 실험실 기법을 기초로했기 때문에하지만, 그것은 또한 수동 단계 (수동 QFA, 표 2)와 로봇의 도움을 대체하여보다 싸게 많이 수행 할 수 있습니다. 수동 QFA는 수동 핀 도구 및 및 사진을위한 인큐베이터에서 접시의 수동 전송을 사용하여 한천 플레이트를 향해 문화 복제 및 접종을 포함한다. 동일한 전산 분석 워크플로우는 두 실험적인 디자인의 성장 곡선을 생성하는 데 적용할 수 있습니다. QFA 휘트니스 견적은 비교적 정확하게 될 것 같습니다. 그림 4에서 기능적으로 관련 유전자 삭제 네 가지 예제 클러스터의 평균 fitnesses가 강조 표시됩니다. 이 independ의 각 기능과 관련된 유전자 클래스의 멤버 근접엔트 유전적 배경 (ura3Δ 및 cdc13-1) QFA 휘트니스 견적의 재현성을 나타냅니다. 예를 들어, 불과 3 유전자 삭제는 (아웃 가능 4,300의) 보존 MRX 복합의 세 멤버를 구분합니다. 미생물 종자의 성장 특성을 테스트하기 위해 QFA까지 고속 처리 대안 SGA 5,6, 분광 플레이트 판독기에 광학 밀도 속도론을 캡처 경쟁 barcoded 라이브러리에서 화면 11,12와 스크린을 포함 표 2에 요약하며 더욱 완벽하게 다른 여덟 설명되어 있습니다 10 . QFA와 문화가 고체 한천 표면 (한천 기반 방법, 표 2)에서 자라는 SGA 판은 로봇에 의해 신속하고 간편하게 처리할 수 있습니다. 고체 한천 표면 문화가 잘 성장 전역 aerated하고 전지는 사교적인 미생물들이 지역 사회 14 성장할 수 있도록 고정 문화권으로 성장할 수있다. 왼쪽 그대로, 미생물 커뮤니티자신의 마이크로 환경 등 에탄올과 같은 secreting 독소, 그리고 아마도 세포 사이에 신호를 ffect. 그러나 적절한 통기를 달성하는 데 필요한 액체 문화의 혼합 지속적인 성장을 인위적으로 자신의 모드에 영향을 미칠 수있는 미생물 지역 사회와 그들의 마이크로 환경을 방해. 문화 사이의 세포를 나르는 액체 많아요을위한 더 적은 기회가 있기 때문에 교차 오염은 고체 한천 방법에 우려의 적습니다. 오염 고체 한천 assays 외국 공기 매개로 미생물에 의해 발생하는 경우, 그것은 흔히 고체 한천 플레이트의 육안 검사에 의해 감지 집결하거나 제거할 수 있습니다. QFA 처리량은 두 가지 방법으로 병렬 액체 방법에 비해 훨씬 높다. 우선, QFA (그리고 SGA) 접시에 주사 문화는 접시 당 독립적인 문화를 제공,보다 밀도가 함께 포장됩니다. QFA 년 308 문화권이 아닌 실험적인 첨단 문화 (그림 1) co.kr 사이트를 세지 않고, 일반적으로있다판 당 96 또는 100의 문화와 액체 문화를 병렬하는 앞에 서. 둘째, QFA 실험은 접시의 훨씬 더 큰 숫자에 따라 결정됩니다. 단일 QFA 실험에서 분석 번호판의 숫자에만 보육이나 따뜻한 방, 최소 허용 이미지 캡처 주파수와 최대 달성 캡처 주파수에서 사용 가능한 공간에 의해 제한되는 반면, 액체 성장 실험 접시의 수를 강력히 제한 플레이트 리더 (일반적으로 하나 또는 두 개의 접시) 또는 플레이트 리더 (일반적으로 25-50 접시)에 연결된 스태커의 용량에 의해. 우리는 최근에 37,884 동시 문화를주는 308 실험적인 문화를 가진 123 접시, 각에서 완전 자동화된 QFA 실험을 실시했습니다. 우리는 액체로 성장하고 독립적인 문화의 최대 달성 번호 96 (문화 / 플레이트)는 것을 예상하고 우리 QFA 처리량보다 열 배 가량 X 50 (플레이트 / 스태커) = 4,800. 액체 배양 화면에 대한 대안은 많은 자동 촉진제을 활용하는 것입니다병렬 wth 장치 (Blomberg 8 시까지 검토에서 표 1), 하나 또는 두 개의 접시의 용량을 가진 각. 각 장치의 온도 제어가 독립적이고, 그래서 조건이 똑같은 건 아니지만, 그들이한다고 가정하고,이 흐름은 적어도 190과 같은 장치가 QFA 처리량 (장치 당 200 액체 문화를 가정)과 일치하도록 요구한다. 요약에서는 QFA는 유용 소규모 focussed 실험 및 높은 처리량 화면에 모두 양적 성장 phenotypes를 수집하기 위해 적용할 수있는 고품질의 흐름이다. 그것은 로봇 장비에 대한 요구 사항 변화에 효과적으로 적용될 수있을만큼 유연합니다. QFA 작업 흐름의 전산 구성 요소를 자유롭게 사용할 오픈 소스 코드를 기반으로합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 복제 광택히 </td><td> 시그마 </td><td> R-2508 </td><td> 1 / 8 &quot;직경 핀으로 96 핀 설명서 pintool </td></tr><tr><td> 메이트를 혼용 </td><td> Eppendorf </td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td> Beckman </td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td> 써모 과학 </td><td> 50095890 </td><td> Biomek FX에 설치된 </td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S &amp; P 로보틱스 INC </td><td> BM3-SC </td><td> 192 선반 회전 회전 목마 </td></tr><tr><td> spImager </td><td> S &amp; P 로보틱스 INC </td><td> spImager </td><td> 고해상도 수동 이미징 </td></tr><tr><td> Cytom있는 spImager에 </td><td> S &amp; P 로보틱스 INC </td><td> 사용자 정의 </td><td> 온도는 자동 고해상도 이미징을 제어 </td></tr><tr><td> 열 교환기와 Cytomat 6001 </td><td> 써모 과학 </td><td> 51022222 </td><td> spImager에 부착된 </td></tr><tr><td> Ecoline RE207 </td><td> Lauda </td><td> RE207 </td><td> Cytomat에 부착된 </td></tr><tr><td> 회전 목마가있는 spImager </td><td> S &amp; P 로보틱스 INC </td><td> 사용자 정의 </td><td> 자동 고해상도 이미징 </td></tr><tr><td> FP12pins위한 로봇 핀 공구 고정구 </td><td> V &amp; P 과학 </td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 X FP12 핀 </td><td> V &amp; P 과학 </td><td> FP12 </td><td> 50.4 mm 길이 17mm는 핀 길이를 노출 </td></tr><tr><td> 핀 도구에 대한 역 도킹 </td><td> V &amp; P 과학 </td><td> VP425 </td><td> 도킹 스테이션베이스 핀이 팬 건조를 허용하도록 제거 </td></tr><tr><td>브러시 청소 핀 </td><td> V &amp; P 과학 </td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 복제 광택히 </td><td> 시그마 </td><td> R-2508 </td><td> 수동 핀 도구 </td></tr><tr><td> 뚜껑이있는 Nunc OmniTray </td><td> Nunc </td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 잘 멸균 폴리스티렌 플레이트 </td><td> Greiner BioOne </td><td> 655,161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 잘 멸균 폴리스티렌 뚜껑 </td><td> Greiner BioOne </td><td> 656,171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> 표 3. 특정 시약 및 장비.

a quantitative fitness analysis workflow

양적 피트니스 분석 (QFA)는 병렬 1,2,3,4 재배 미생물 문화 fitnesses을 비교하기위한 실험 및 전산 작업 흐름이다. QFA은 단일 문화 focussed 관찰에 적용하지만, 독립적인 문화 수천까지 조사 게놈 전체 유전자 상호 작용이나 약물 화면에 가장 유용합니다. 중앙 실험 방법은 incubated 정기적으로 촬영되는 고체 한천 플레이트를 향해 독립 묽은 액체 미생물 문화의 접종이다. 매번 포인트에서 사진이 양적 피트니스 조치 얻을 수 있도록, 성장 곡선을 만드는 데 사용되는 정량 셀 밀도 견적, 제작, 분석하고 있습니다. 문화 fitnesses는 계량 및 유전적 상호 작용 강점이나 약물 감성 순위를 비교할 수 있습니다. 모든 치료의 문화 적합성에 대한 효과는 기판 한천 (예 : 작은 분자, 항생제 또는 영양분)에 추가하거나 접시 외부에 적용단조 (예 : 자외선 조사, 온도)이 QFA에 의해 계량하실 수 있습니다. QFA 흐름은 성장률이 96도 또는 200도 플레이트 리더에 평행 액체 문화의 분광 측정으로 얻은 것과 유사한 추정 생산하고 있습니다. 중요한 것은, QFA 같은 방법에 비해 훨씬 높은 처리량을 가지고 있습니다. QFA 배양 고체 한천 표면에 성장하므로 잘 교반이나 흔들림없이도 성장하는 동안 aerated됩니다. QFA 처리량 일부 합성 유전자 배열 (SGA) 전형 방법 5,6의만큼 높지 않을 것입니다. QFA 문화가 많이 한천로 주사되기 전에 희석되기 때문에 그러나, QFA 3 지수와 채도 단계를 포함하여보다 완벽한 성장 곡선을 캡처할 수 있습니다. 예를 들어, 성장 곡선 관찰 이전에 한 논의로 문화 더블링 시간이, 높은 정밀도와 직접 견적을 계산할 수 있습니다. 여기 소개특정 QFA 프로토콜 S. 수천에 적용 자동 접종, 배양 및 이미징 동안 로봇에 의해 처리됩니다 cerevisiae 문화. 이러한 자동화된 단계에는 처리량의 관련 감소와 함께 이에 상응하는, 수동 프로 시저로 대체하고, 우리는 또한 낮은 처리량 매뉴얼 프로토콜을 제시 할 수 있습니다. 동일한 QFA 소프트웨어 도구 중 워크플로우에서 촬영한 이미지에 적용할 수 있습니다. 우리는 광범위한 경험 신진 효모의 문화 QFA를 적용했습니다 S. 하지만 우리는 QFA는 분열 효모의 문화를 조사에 동일하게 유용 것으로 cerevisiae를 기대 S. pombe와 세균성 문화.

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A Quantitative Fitness Analysis Workflow

양적 피트니스 분석 (QFA)는 미생물 문화 fitnesses을 계산하는 실험 및 전산 방법을 보완 시리즈입니다. QFA는 유전자 변이, 약물이나 미생물의 성장에있는 다른 적용 트리 트먼트의 효과를 추정하고있다. 단일 문화권의 focussed 분석에서 병렬 문화 수천 실험 스케일링을 설계할 수 있습니다.

양적 휘트니스 분석 워크플로우

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Research

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