Name: a quantitative fitness analysis workflow
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fitness Analysis Workflow at JoVE.com

Vi ønsker å takke for alle medlemmer i vårt laboratorium og Senter for integrert system Biology of Ageing and Nutrition (CISBAN) for støtte og nyttige diskusjoner. Denne studien ble støttet av bioteknologi og Biologisk Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) og Wellcome Trust (075294, 093088).

Manuell QFA Protocol (for S. cerevisiae stammer) 1. Dyrkning Gjær Stammer <ol><li> Opp til 96 uavhengige gjær stammer dyrkes i 200 mL av rike flytende medier i en 96-brønns kultur parabolen. De stammer dyrkes til metning i en temperatur kontrollert inkubator. </li><li> En 96 pin, 1/8 &quot;diameter manuell replica plater (SIGMA R-2508) er sterilisert ved først å dyppe den replikaen plater i 100% etanol, flammende og deretter forlate avkjøles. </li><li> 200 mL sterilt vann er kledd i en 96-brønns kultur plate. De mettede kulturer vortexed (Eppendorf MixMate, 30 sek, 750 rpm) og fortynnes ved å dyppe den sterilisert pin verktøyet inn i mettet stammer tre ganger så inn platen som inneholder vann en gang. </li><li> Stiften Verktøyet er re-steriliseres som per 1.2. </li><li> Den steriliserte pin verktøyet brukes til å oppdage den fortynnede kulturen på selges agar plater ved å dyppe inn platen som inneholder den fortynnede kulturen tre gangern overføre pin verktøyet til en rektangulær solid agar plate. </li><li> De rektangulære solide agar plater inkubert ved en passende temperatur før de blir fotografert manuelt med en S &amp; P Robotics spImager. Alternative bildefotografering metoder kan også brukes som en LAS4000 FujiFilm, eller en rimeligere digitalt speilreflekskamera hvis omsorg er tatt for å sikre jevn belysning og konsistent plate posisjonering i forhold til kamera. </li><li> Metoden er tilpasningsdyktig til mindre antall parallelle kulturer, for eksempel 48, som kan monteres på runde petriskåler hvis omsorg er tatt for å sikre at den samme vinkelen i forhold til kamera under hvert bilde. </li></ol> Helautomatisk QFA Protocol (for S. cerevisiae stammer) 2. Dyrkning Gjær Stammer <ol><li> Start med et rektangulært utvalg av uavhengige gjær stammer vokser på fast agar. I dette eksempelet start stammer er resultatet av krysset en temperatursensitiv spørring mutasjon med gjær Sletting Collection (YDC) av syntetisk Genetisk Array (SGA). Endelige SGA platene er i 1536-format. Dette er 16 rader med 24 kolonner med kolonier / kulturer representerer fire replikater av 384 uavhengige gjær stammer. Se figur 1 for plate oppsett. </li><li> 384 stammer out of 1536 blir overført robotically bruker en S &amp; P Robotics Inc BM3-SC robot med en 96 pin, 1-mm pin diameter sterilt pintool inn i fire 96-vel kultur plater som inneholder 200 mL av selektive medier (figur 1). Pintool renslighet og sterilitet oppnås ved å sekvensielt vask i sterilt vann to ganger (en gang med en roterende børste for å fjerne rusk), 70% etanol (med sonikator) og til slutt 100% etanol. </li><li> De kulturer dyrkes til metning (for tre dager ved 20 ° C i dette eksempelet, se figur 1). </li></ol> 3. Spotting Gjær kulturer <ol><li> Ved hjelp av en Beckman Biomek FX, mettede kulturer enre resuspendert av virvling på en Variomag Teleshake (mot urviseren ved 1000rpm i 20 sekunder) og fortynnes ca 1:70 ved å feste inn 200 mL sterilt vann ved hjelp av en steril 96 pin robot pin verktøy (V &amp; P Scientific magnetisk montering pintool, 2 mm pin diameter). Pin verktøy renslighet og sterilitet oppnås ved å vaske i sterilt vann, vask i 70% etanol (med en pensel for å fjerne rusk) og til slutt dyppe i 70% etanol etterfulgt av tørking. </li><li> Utvannet kulturer er prikket inn solide agar plater i 384-format ved hjelp av den samme robot pin verktøyet (se figur 1) etter rengjøring og sterilisering. </li><li> Etter pinning, blir platene overført til en Cytomat temperatur kontrollert, fuktet inkubator med automatisk karusell og tilgang luke. </li></ol> 4. Image Capture <ol><li> En S &amp; P Robotics automatisert imager fjerner gjentatte ganger platene fra Cytomat inkubator, fjerner plate lokket, plasserer dem nøyaktig under en vedlegged, jevnt opplyst plass under et Canon EOS Rebel Ti 35mm DSLR, fanger et bilde på 5184 x 3456 px oppløsning, erstatter plate lokket, og returnerer dem til inkubatoren karusellen. Ett bilde er tatt umiddelbart etter innledende overføring til inkubatoren for å tillate en null tidspunkt vekst måling (bakgrunn). Robot håndtering og fotografering tar 2 minutter per plate. </li><li> Med en fullastet karusell, er den maksimale oppnåelige platen bildeopptak frekvens ett bilde hver sjette time. Plater inkuberes i opptil seks dager (inntil kolonien vekst metning. Figur 1 viser tre typiske bilder fra en time-kurs ved 20 ° C. </li><li> For sporing, blir platene navngitt i henhold til inkubator navn, temperatur, unikt sekvensielt batchnummer og posisjon i kuvøse. Bilde navnene er en sammensetning av plate navn og tidsstempel og blir automatisk bygget på Image Capture (f.eks K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg, File Type FT1, Tabell1). </li></ol> 5. Capture of Experimental Metadata De metadatafilene beskrevet i dette avsnittet er tabulatordelte tekstfiler som blir manuelt generert (f.eks ved hjelp av regneark programvare). Eksperimentell Description fil (FT2, Tabell 1) er unikt for hvert forsøk, men biblioteket Beskrivelse (FT3, Tabell 1) kan gjenbrukes i stor utstrekning en gang konstruert. <ol><li> Eksperimentet er beskrevet i Experimental Description filen (FT2, Tabell1) inneholder kolonner for strekkode (eller automatisk generert plate navn), eksperiment starter tidsstempel, plate behandling, innholdet av fast agar medium, skjermnavn, bibliotek, plate nummer (for biblioteker med flere plater) og en repeat-kvadrant nummer (se figur 1) for skalering ned fra 1536 format til 384 format. </li><li> Den gjær belastningen biblioteket er beskrevet med en Library Beskrivelse fil (FT3, <strong&gt; Tabell1) angivelse av genotype vokst i hver kultur plassering i hver plate av et bibliotek. Den inneholder kolonner for: bibliotek navn, ORF, plate nummer, plate rad, plate kolonne og en valgfri notater kolonne. </li><li> En valgfri Standard Gene Navn fil (FT4, Tabell 1) beskriver standard genet navn (f.eks RAD9) knyttet til hver systematisk ORF y-nummer (f.eks YDR217C) identifisere stammer bli screenet kan gis. Denne filen inneholder to kolonner: ORF &amp; Gene navn. </li></ol> 6. Data Analysis Den QFA beregningsorientert arbeidsflyt krever tilgang til en rimelig kraftig multicore datamaskin arbeidsstasjon (f.eks en Dell Precision T3500 med Xeon quad-core 2,67 GHz prosessor og 12GB RAM) som er installert Colonyzer bildeanalyse programvare verktøyet 3,4 og QFA R pakken 7 , som begge er dokumentert på nettet, er fritt tilgjengelig og kjøres på en rekke operativsystemer. <ol><li>Kjør Colonyzer med hver av de fangede plate bildene som innspill, generere en Colonyzer Output fil (FT5 tabell 1) for hvert bilde du har tatt. Colonyzer utdatafiler spesifisere kultur tetthet estimater, kultur areal, form og farge for hver av de 384 stedene på avbildes plate. Utgang filnavn blir automatisk kopiert fra kildebildet filnavn (f.eks plate fotografiet K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1, Tabell 1) tilsvarer Colonyzer utdatafilen K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat ( FT5, Tabell 1)). </li><li> Bruke QFA R pakken, laste eksperimentell metadata (FT2, Tabell1) og Colonyzer utdatafiler (FT5 tabell 1). Disse dataene er flettet inn i R datarammer (som kan eksporteres som QFA rådata tekstfiler (FT6, Tabell 1)) for videre analyse. </li><li> Den QFA R-pakken inneholder funksjoner for å samle celletetthet timecourses for hver kultur, til å passe generalisert logistic befolkningen modeller til observasjoner og å plotte begge (se figur 2 og 3 for eksempler). Spesiallys parameterverdiene er skrevet for å QFA Logistic parameterfiler (FT7 tabell 1). Se QFA R pakke dokumentasjon for ytterligere detaljer. </li><li> Den QFA R-pakken inneholder også funksjoner for kvalitetskontroll: edge kolonier forkastes på grunn av økt tilgjengelighet av næringsstoffer ved metallkanter og problemer med bildeanalyse nær plate vegger, kulturer som mislykkede SGA og genotyper viser kobling med skjerm-spesifikke markør gener fjernes fra analysen. </li><li> Flere kvantitative fitness tiltak er avledet fra logistiske befolkningsundersøkelser modell parametere for hver kultur. Disse inkluderer maksimale befolkningen dobling priser (MDR) og antall divisjoner fra inokulasjon til metning (MDP). For hvert sett gjentatte kulturer (av unike genotype for eksempel) og for hver fitness definisjon, flere sammendrag statistikk over fitness anslagene er computed: gjennomsnitt og median fitness, fitness standardavvik og antall duplikater observert. Statistikken er utgang til QFA Fitness Sammendrag filer (FT8, Tabell 1) for videre analyse, f.eks beregning av genetisk interaksjon score (FT9 tabell 1). </li></ol> 7. Representative Resultater Figur 2 viser en typisk vekstkurve ut av 384 QFA kulturer vokser ved 20 ° C på solid agar som kvantifiseres ved Colonyzer, med økning i celle tetthet første blir synlig etter ca 2 dager. Denne forsinkelsen er sannsynligvis en kombinert effekt av en kultur etterslep fase etter inokulasjon på fast medium og en nedre deteksjonsgrense for celle tetthet. Figur 3 viser 308 lignende vekstkurver tatt fra en enkelt plate. Figur 4 viser en sammenligning av to genom-wide QFA skjermer å antyde genetiskinteraksjon styrker (tilpasset fra 1). Den QFA R-pakken 7 inneholder også funksjoner for å produsere Figur 3 og hente ut rangerte lister over undersøkte genotyper og estimater av genetisk interaksjon styrke (GIS), sammen med en q-verdi (False funnrate (FDR) korrigert p-verdi) for betydningen av observerte GIS. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4018/4018fig1.jpg" /> Figur 1. Ordning for robot inokulering av gjær stammer i 384-spot format. Denne prosedyren starter med 1536 uavhengige kulturer per plate (venstre). I dette typisk eksempel kolonier i posisjonene 1,1, 1,2, 2,1 og 2,2 (farget rød) er fire gjentak av samme genotype his3 :: KANMX kulturer i gult, vokser på kanten av tallerkenen. , har en vekst fordel på grunn av manglende konkurranse, og er derfor ikke undersøkt av QFA. En av disse replikater (f.eks 1,1) blir inokulert til flytende vekstmedier i 96-brønn plate<html> s ved hjelp av en 96-pinners verktøy som inoculates 96 av 1536 kolonier hver gang. For å vaksinere en gjengivelse for hver av 384 genet slettinger, fire forskjellige &quot;kvadranter&quot; (angitt som rød, blå, grønn og lilla) blir inokulert i fire ulike 96-brønners plater som inneholder vekstmedier. Etter vekst til metning (f.eks 3 dager ved 20 ° C), er kulturer fortynnet i vann, så de fire kvadrantene fra en rapport er oppdaget i 384-format på en solid agar plate (til høyre) i samme mønster som den opprinnelige SGA plate (som angitt av farge). Prosessen kan gjentas for å teste andre gjentak: 1,2, 2,1 og 2,2. Eksempel time-lapse bilder på høyre ble fanget 0,5, 2 og 3,5 dager etter inokulasjon. Tilpasset fra Supplementary Figur 1 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . 018/4018fig2.jpg &quot;/&gt; Figur 2. En enkelt robot-fanget QFA vekstkurve. A) QFA vekst kurve av en gjær belastning vokser på agar inneholder galaktose ved 20 ° C. Bilder ble tatt til fange robotically ca hver 2 time. Eksponentielle fasen ved denne temperaturen ble observerbare for cirka 1,5 dager, med kultur tetthet økning første bli synlig ca 2 dager etter inokulasjon. En generell logistiske modellen ble passe til de observerte data (grå kurve). Modell parametere automatisk montert ved QFA R pakken presenteres: K (nyttelast (AU)), R (vekstrate (d -1)), g (podestoff tetthet (AU)), v (vekst symmetri). B) Som for panel A, plottet med celle tetthet på en log skala. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4018/4018fig3.jpg" /> Figur 3. Automatisk genet<html> rangerte vekstkurver fanget i parallell fra en enkelt 384-format plate. Hvert panel viser celletetthet estimater (røde kors) og modelltilpasning (svarte kurver) for uavhengige kulturer merket med genet navn eller ORF y-nummer vokst i en QFA prosedyre. Dette eksempelet plate ble fotografert av robot og vokst i en automatisert inkubator ved 20 ° C. Eksperimentell metadata blir automatisk inkludert i figuren tittelen: plate navn, plate behandling, agar medium og bibliotek plate nummer. Spesiallys modell parameterverdiene er også skrives automatisk ut på hvert panel (se figur 2). Edge kulturer ble strippet fra QFA analyse, forlater de 308 kulturer i denne tomten (se QFA Protocol 5.4). Siden edge kulturer ikke er analysert i QFA, er disse kultur stedene vanligvis fylt med nøytrale kontrollstammer (pGAL-HIS3 i dette tilfellet). Den opprinnelige versjonen av dette tallet, er produksjonen ved QFA R pakken, i. Pdf format og er derfor uendelig zoomable og søkbar tekst spørringer.:/ / Www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig3.pdf &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klikk her for å se større figur. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4018/4018fig4.jpg" /> Figur 4. Sammenligning fitnesses fra to QFA skjermer å utlede genetisk interaksjon. Denne tomten viser sammenligning av egnethet av spirende gjær delesjoner (yfgΔ) kombinert med den nøytrale ura3Δ mutasjon eller temperatur sensitive cdc13-1-mutasjon og vokst på det semi-ettergivende temperatur for cdc13- 1 (27 ° C). Fitness ble beregnet som produktet av maksimal dobling hastighet og maksimal dobling potensial 1. De fleste sletting stammer vokser godt i kombinasjon med nøytrale ura3Δ mutasjonen, som forventet og har høy kondisjon, men sletting kombinert med cdc13-1 har et bredt spekter av fitnesses. De lyseblå linjene krysser ved the plasseringen av den nøytrale his3Δ mutasjon, er heltrukken linje en lineær regresjonsmodell av genetisk uavhengighet (forventet skikkethet cdc13-1 yfgΔ mutanter gitt egnethet av ura3Δ yfgΔ mutanter) og den stiplede linjen er den linjen lik fitness. Slettinger farget grønn betydelig forbedre kondisjon mangelen av cdc13-1 stammer. Slettinger farget rød betydelig undertrykke den samme feilen. Vertikal avstand av noen mutasjon cdc13-1 yfgΔ fra den heltrukne linjen angir styrken av genetisk interaksjon mellom cdc13-1 og yfgΔ under platen forhold. Merk at noen av de sterkeste suppressors av cdc13-1 er tidligere identifisert checkpoint gener, RAD17, DDC1 og RAD24 og nuclease EXO1 nær toppen til høyre. Gener som sletting reduserer fitness inkludere YKU80 (koding av DNA-reparasjon og telomere capping protein Yku80) nær<html> nederst til høyre. Merk også at enkelte grupper av gener som fungerer sammen tendens til å være samlokalisert på denne tomten. Tre eksempler på klynger er uthevet i SPE1 blått, SPE2 og SPE3: spermidine syntese gener, RAD17 og DDC1 og RAD24: koding komponenter av sjekkpunkt glidende klemmen og sjekkpunkt klemme loader, MRE11, RAD50 og XRS2: den MRX komplekset, er involvert i DDR og EST1 &amp; EST3: gener involvert i telomere lengde regulering. Tilpasset fra Supplementary Figur 1B 1, kan rådata som dette plottet ble generert lastes ned herfra: <a href="http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/" target="_blank">http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/</a> . <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig4.pdf" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . &quot;&gt; <tbody><tr><td> Fil ID </td><td> File Type </td><td> Manuelt Konstruert </td><td> Oppdater Frekvens </td><td> Forutsetning </td></tr><tr><td> FT1 </td><td> Plate fotografi </td><td> Ingen </td><td> Per plate &amp; endepunktet </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT2 </td><td> Eksperimentell Beskrivelse </td><td> Ja </td><td> Per eksperiment </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT3 </td><td> Bibliotek Beskrivelse </td><td> Ja </td><td> Per bibliotek </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT4 </td><td> Standard Gene navn </td><td> Ja </td><td> Per bibliotek </td><td> Ingen </td></tr><tr><td> FT5 </td><td> Colonyzer utgang </td><td> Ingen </td><td> Per endepunktet per plate </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT6 </td><td> QFA Rå Data </td><td> Ingen </td><td> Per eksperiment </td><td> - </td></tr><tr><td> FT7 </td><td&gt; QFA Logistic Parametere </td><td> Ingen </td><td> Per eksperiment </td><td> - </td></tr><tr><td> FT8 </td><td> QFA Fitness Oppsummering </td><td> Ingen </td><td> Per eksperiment </td><td> - </td></tr><tr><td> FT9 </td><td> QFA genetisk interaksjon Søket </td><td> Ingen </td><td> Per GIS studie (2 expts.) </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Elektroniske QFA filer. Alle filene som er oppført (unntatt FT1) er tabulatordelte tekstfiler og kan konstrueres eller leses med et tekstredigeringsprogram eller et regneark programvare. For nærmere informasjon om bygging QFA metadatafilene og presis tolkning av QFA utgang se QFA R pakken dokumentasjon 7 og Colonyzer programvaredokumentasjonen tre. <img src="/files/ftp_upload/4018/4018table2.jpg" alt="Tabell 2" /> Tabell 2. Metoder for å vurdere kulturen fitness. Et sammendrag av funksjonene og krevermenter av en rekke metoder for å vurdere mikrobiell kultur fitness. En gjennomgang av Blomberg 8 inneholder mer detaljert sammenligning av noen av disse. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018table2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> .

<ol>
	<li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects.">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362 (2011).</li><li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li><li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonyzer:+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar.">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li><li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping.">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li><li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70&#916;mutants.">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70&#916;mutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li><li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li><li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li><li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries.">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864 (2011).</li><li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants.">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li><li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+ecology:+The+social+side+of+wild+yeast.">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

QFA er på mange sanser en direkte etterkommer av tre etablerte benk-skala mikrobiologiske teknikker: kultur fortynning serien stikkprøver 9, vekstkurve bestemmelse i karbonisert flytende kulturer 9 og kopi plating 13. Disse tre metodene er oppsummert og sammenlignet med QFA og andre high-throughput teknikker i tabell 2. Mens fortynning serien stikkprøver definere en belastning egnethet som evne til å danne kolonier i en rekke kulturer vokst fra en rekke podestoff fortynninger, til QFA tiltak belastningen fitness ved gjentatte observasjoner av en enkelt kultur konstruere en vekst kurve. Kvantifisering fitness fra enkle kulturer kan mange flere stammer skal undersøkes samtidig, under identiske forhold. Innlæring matriser av kulturer tillater gjentatt testing av belastningsskader samlinger, mest nyttige ting når jeg tester for kultur fitness forskjeller i ulike miljøer eller genetiske bakgrunn. Den QFA protokollen presenterther bruker dyrt robot-utstyr å gjenskape, vaksinere, inkuber og bilde agar plater, passende for å observere vekst av tusenvis av uavhengige kulturer (robot QFA, tabell 2). Men siden QFA er basert på etablerte, tradisjonelle lab teknikker, kan det også utføres mye billigere ved å erstatte robot hjelp med manuelle trinn (manuell QFA, tabell 2). Manuell QFA innebærer replikering og poding av kulturer inn på agar plater ved hjelp av en manuell pin verktøy og manuell overføring av platene til og fra en inkubator for fotografering. Det samme beregningsanalyse arbeidsflyten kan brukes til å generere vekstkurver fra enten eksperimentelt design. QFA fitness anslag synes å være relativt presise. I figur 4 er gjennomsnittlig fitnesses av fire eksempel klynger av funksjonelt beslektede gener slettinger uthevet. Nærheten av medlemmer av hvert funksjonelt beslektede gener klassen i to uavhengigeskjellige genetiske bakgrunn (ura3Δ og cdc13-1) angir reproduserbarhet QFA fitness estimater. For eksempel bare tre genet slettinger (ut av en mulig 4300) skiller de tre medlemmene av konservert MRX komplekset. High-throughput alternativer til QFA for testing vekstkarakteristikker av mikrobielle stammer inkluderer 5,6 SGA, konkurranse skjermer i strekkodet biblioteker 11,12 og skjermer fange optisk tetthet kinetikk i Spektrofotometrisk plate lesere 10 som er oppsummert i Tabell 2 og beskrevet mer fullstendig annet sted 8 . QFA og SGA plater, der kulturer vokser på solide agar overflater (agar baserte metoder, tabell 2) kan håndteres raskt og enkelt ved robot. Solid agaroverflaten kulturer er godt luftet gjennom vekst og cellene kan vokse i faste kulturer, slik at sosiale mikrober å vokse i et fellesskap 14. Intakt, mikrobielle samfunn etffect sin egen mikro-miljøer, sekresjon giftstoffer som etanol, og muligens signalering mellom cellene. Men kontinuerlig blanding av flytende kulturer, nødvendige for å oppnå tilstrekkelig lufting, kunstig forstyrrer mikrobielle samfunn og deres mikro-miljøer som kan påvirke deres moduser av vekst. Cross-forurensning er mindre av en bekymring i solide agar metoder siden det er mindre mulighet for væskesprut frakter celler mellom kulturer. Dersom forurensning skjer ved utenlandske luftbårne mikrober i solide agar-analyser, kan det ofte bli oppdaget ved visuell inspeksjon av faste agar plater og sto for eller fjernet. QFA gjennomstrømning er betydelig høyere enn for parallelle flytende metoder på to måter. Først av alt, på QFA (og SGA) plater, er inokulerte kulturer pakket sammen tettere, noe som gir mer selvstendige kulturer per plate. I QFA er det vanligvis 308 kulturer, ikke medregnet ikke-eksperimentelle edge kulturer (figur 1) comsammenlignet med parallell flytende kulturer med 96 eller 100 kulturer per plate. Dernest kan QFA eksperimenter bli skalert til en mye større antall plater. Mens antall plater analysert i en enkelt QFA eksperiment er bare begrenset av tilgjengelig plass i en inkubator eller varme rom, minstekravet Image Capture frekvens og høyest oppnåelige fangst frekvens, er antall plater i en væske vekst eksperiment sterkt begrenset av kapasiteten på plateavleseren (vanligvis én eller to plater), eller av stabler festet til plateavleseren (typisk 25-50 plater). Vi har nylig gjennomført en helautomatisk QFA eksperiment på 123 plater, hver med 308 eksperimentelle kulturer, noe som gir 37,884 samtidige kulturer. Vi anslår at maksimalt oppnåelig antall uavhengige kulturer vokser i flytende er 96 (kulturer / plate) x 50 (plater / stabling) = 4800, som er rundt ti ganger mindre enn vår QFA gjennomstrømming. Et alternativ for flytende kultur skjermer er å utnytte mange automatisert growth enheter i parallell (tabell 1 fra gjennomgangen av Blomberg 8), som hver har en kapasitet på en eller to plater. Temperaturkontroll i hver enhet er uavhengig, og så forholdene er ikke identiske, men forutsatt at de er, ville dette arbeidsflyten krever minst 190 slike enheter for å matche QFA gjennomløp (forutsatt 200 flytende kulturer per enhet). Oppsummert er QFA en høy kvalitet arbeidsflyt som kan nyttiggjøre å samle kvantitative vekst fenotyper i begge småskala fokusert eksperimenter og høy gjennomstrømning skjermer. Det er fleksibelt nok til å brukes effektivt med varierende krav til robot utstyr. Den beregningsorientert komponenten av QFA arbeidsflyten er basert på fritt tilgjengelig, åpen kildekode.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens / utstyr </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> 96 pin manuell pintool med 1/8 &quot;diameterboltene </td></tr><tr><td> Bland Mate </td><td> Eppendorf </td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td> Beckman </td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td> Thermo Scientific </td><td> 50095890 </td><td> Monteres på Biomek FX </td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> BM3-SC </td><td> 192 hylle roterende karusell </td></tr><tr><td> spImager </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> spImager </td><td> Høy oppløsning manuell bildebehandling </td></tr><tr><td> spImager med Cytomved </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Custom </td><td> Temperaturstyrt automatisert høy oppløsning </td></tr><tr><td> Cytomat 6001 med varmeveksler </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51022222 </td><td> Festet til spImager </td></tr><tr><td> Ecoline RE207 </td><td> Lauda </td><td> RE207 </td><td> Festet til Cytomat </td></tr><tr><td> spImager med karusell </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Custom </td><td> Automatisert høy oppløsning </td></tr><tr><td> Robot pin verktøy festeanordning for FP12pins </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 x FP12 pins </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> FP12 </td><td> 50,4 mm lang, 17 mm utsatt pin lengde </td></tr><tr><td> Docking Station for Pin Tool </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP425 </td><td> Docking stasjon basen fjernes for å tillate fan tørking av pins </td></tr><tr><td>Pin Rengjøringsbørste </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> Manuell pin verktøy </td></tr><tr><td> Nunc OmniTray med lokk </td><td> Nunc </td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 vel sterile isopor plater </td><td> Greiner BioOne </td><td> 655161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 vel sterile isopor lokk </td><td> Greiner BioOne </td><td> 656171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabell 3. Spesifikke reagenser og utstyr.

a quantitative fitness analysis workflow

Kvantitativ fitnessanalyse (QFA) er en eksperimentell og beregningsorientert arbeidsflyt for å sammenligne fitnesses av mikrobielle kulturer dyrket parallelt 1,2,3,4. QFA kan brukes fokuserte observasjoner av single kulturer, men er mest nyttig for genom-wide genetisk interaksjon eller narkotika-skjermer undersøke opptil tusenvis av uavhengige kulturer. Den sentrale eksperimentelle metoden er den inokulering av uavhengige, fortynnede væske mikrobielle kulturer inn på solide agar plater som ruges og regelmessig fotografert. Fotografier fra hver gang-punkt blir analysert, produserer kvantitative celletetthet estimater, som brukes til å konstruere vekstkurver, slik at kvantitative fitness tiltak for å bli utledet. Kultur fitnesses kan sammenlignes å kvantifisere og rangere genetisk interaksjon styrker eller narkotika overfølsomhet. Effekten på kultur egnethet av eventuelle behandlinger lagt inn substrat agar (f.eks små molekyler, antibiotika eller næringsstoffer) eller påføres plater utvendigly (f.eks UV bestråling, temperatur) kan kvantifiseres ved QFA. Den QFA arbeidsflyten produserer vekst anslår analogt til de som er fremstilt ved spektrofotometrisk måling av parallelle flytende kulturer i 96-brønn eller 200-brønnen plate lesere. Viktigere, har QFA betydelig høyere gjennomstrømning sammenlignet med slike metoder. QFA kulturer vokse på en solid agaroverflaten og er derfor godt luftet under vekst uten behov for å røre eller riste. QFA gjennomstrømning er ikke så høy som i noen Syntetisk Genetisk Array (SGA) screening metoder 5,6. Men siden QFA kulturer er sterkt fortynnet før de inokulert på agar, kan QFA fange mer komplette vekstkurver, inkludert eksponential og metning faser tre. For eksempel, vekstkurve observasjoner tillate kultur dobling ganger til estimeres direkte med høy presisjon, som omtalt tidligere en. Her presenterer vi enspesifikk QFA protokollen brukt tusenvis av S. cerevisiae kulturer som håndteres automatisk av roboter under inokulasjon, inkubasjon og bildebehandling. Alle disse automatiserte tiltak kan erstattes av en tilsvarende, manuell prosedyre, med en tilhørende reduksjon i gjennomstrømning, og vi også presentere en lavere gjennomstrømming manuell protokoll. De samme QFA programvare verktøy kan brukes til bilder tatt i enten arbeidsflyt. Vi har lang erfaring søker QFA til kulturer i spirende gjær S. cerevisiae men vi forventer at QFA vil være like nyttig for å undersøke kulturer av fisjon gjær S. pombe og bakteriekulturer.

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fitness Analysis Workflow at JoVE.com

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Kvantitativ fitnessanalyse (QFA) er en komplementær serie eksperimentelle og beregningsmetoder for estimering av mikrobielle kultur fitnesses. QFA anslår effekten av genetiske mutasjoner, narkotika eller andre gjaldt behandlinger på mikrobe vekst. Eksperimenter skalering fra fokusert analyse av single kulturer til tusenvis av parallelle kulturer kan utformes.

En kvantitativ fitnessanalyse Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Kvantitative Live-Cell fluorescens-mikroskopi Analyse av Fission gjær

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Kvantitativ analyse av Random migrasjon av celler ved hjelp av Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Kvantitativ analyse av Autophagy med Avansert 3D fluorescens mikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

En høy gjennomstrømning MHC II Binding Assay for kvantitativ analyse av peptidepitoper

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

En ny teknikk for Kvantitativ analyse av Håravfall i Mus Bruke gråtoner Analyse

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Komplett arbeidsflyt for analyse av Histone posttranslasjonelle modifikasjoner hjelp Bottom-up massespektrometri: Fra Histone Utvinning til dataanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.