Name: a quantitative fitness analysis workflow
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00
Duration: 11 min 39 s
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Queremos agradecer a todos los miembros de nuestro laboratorio y el Centro para la Biología de Sistema Integrado de Envejecimiento y Nutrición (CISBAN) para el apoyo y útiles debates. Este estudio fue apoyado por las Ciencias Biológicas y la Biotecnología Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) y el Wellcome Trust (075294, 093088).

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	<li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects.">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362 (2011).</li><li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li><li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonyzer:+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar.">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li><li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping.">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li><li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70&#916;mutants.">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70&#916;mutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li><li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li><li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li><li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries.">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864 (2011).</li><li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants.">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li><li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+ecology:+The+social+side+of+wild+yeast.">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

QFA es en muchos sentidos, un descendiente directo de los tres establecidos a escala de banco técnicas microbiológicas: cultura dilución, pruebas in situ de la serie 9, la determinación de la curva de crecimiento en cultivos líquidos aireados y las planchas del 9 de réplica 13. Estos tres métodos se resumen y se comparan con QFA y otras técnicas de alto rendimiento en la Tabla 2. Considerando que la dilución, pruebas in situ de la serie definirá la aptitud de una cepa como su capacidad de formar colonias en una serie de culturas cultivadas a partir de una serie de diluciones del inóculo, QFA gimnasio cepa medidas por parte de las observaciones repetidas de una misma cultura para construir una curva de crecimiento. Cuantificación de la aptitud de los cultivos individuales permite muchas cepas más a ser examinada simultáneamente, bajo condiciones idénticas. Replicar las matrices de las culturas permite repetir la prueba de las colecciones de la cepa, el más útil cuando las pruebas de diferencias de aptitud de cultivo en diferentes ambientes o las bases genéticas. El protocolo presentado QFAaquí utiliza equipos robóticos costosas de duplicar, inocular, incubar y las placas de agar de imagen, adecuada para observar el crecimiento de miles de culturas independientes (robótica QFA, Tabla 2). Sin embargo, puesto QFA se basa en técnicas establecidas, de laboratorio tradicionales, sino que también puede llevarse a cabo mucho más barata mediante la sustitución de asistencia robot con pasos Manual (Manual de QFA, Tabla 2). Manual de QFA implica la replicación y la inoculación de los cultivos sobre discos de agar con una herramienta manual de pin y la transferencia manual de las placas hacia y desde una incubadora para la fotografía. El flujo de trabajo mismo análisis computacional puede ser aplicado para generar curvas de crecimiento de cualquier diseño experimental. QFA estimaciones salud física parecen ser relativamente precisa. En la Figura 4, las eficacias medias de cuatro grupos de ejemplo de supresiones de genes funcionalmente relacionados se destacan. La proximidad de los miembros de cada clase de genes relacionados funcionalmente en dos independenciarentes orígenes genéticos (ura3Δ y cdc13-1) indica la reproducibilidad de QFA estimaciones de fitness. Por ejemplo, sólo tres supresiones de genes (de un máximo de 4.300) separar a los tres miembros del complejo MRX conservada. De alto rendimiento alternativas a QFA para probar las características de crecimiento de cepas microbianas incluyen SGA 5,6, las pantallas de la competencia en las bibliotecas de código de barras y pantallas de captura de 11,12 cinética de la densidad óptica de lectores de placas espectrofotométrico 10, que se resumen en la Tabla 2 y se describe más detalladamente en otro lugar 8 . QFA y placas SGA, donde las culturas crecen en las superficies de agar agar (sólidos basados ​​en métodos, Cuadro 2) se puede manejar de forma rápida y fácil por el robot. Sólidos culturas superficie del agar son bien aireado durante todo el crecimiento y las células pueden crecer en cultivos fijos, permitiendo microbios sociables a crecer en una comunidad 14. Dejado a las comunidades microbianas intactas, unFECTOS sus propios micro-ambientes, toxinas que secretan tales como etanol, y posiblemente de señalización entre las células. Sin embargo, la continua mezcla de culturas líquidas, necesarias para lograr una aireación adecuada, de forma artificial altera las comunidades microbianas y sus entornos de microorganismos que puedan afectar a su modo de crecimiento. La contaminación cruzada es una preocupación menor en los métodos de agar sólido ya que hay menos oportunidad para que las salpicaduras de líquidos que transportan las células entre las culturas. Si se produce contaminación por el aire exterior transmitidas por microbios en los ensayos de agar sólido, a menudo puede ser detectada mediante inspección visual de las placas de agar sólido y representó o eliminado. Rendimiento QFA es significativamente mayor que la de paralelas métodos líquidos de dos maneras. En primer lugar, en QFA (y SGA) placas, cultivos inoculados se empaquetan con mayor densidad, lo que las culturas más independientes por placa. En QFA normalmente hay 308 culturas, sin contar las no experimentales culturas de borde (Figura 1) comcomparación en paralelo cultivos líquidos con 96 o 100 por placa culturas. En segundo lugar, los experimentos QFA se puede escalar a un número mucho mayor de las placas. Considerando que el número de placas analizadas en un único experimento QFA sólo está limitado por el espacio disponible en una sala de incubadora o caliente, la frecuencia mínima permisible de captura de imágenes y la frecuencia máxima alcanzable captura, el número de placas en un experimento de crecimiento líquido es fuertemente limitado por la capacidad del lector de placas (normalmente una o dos placas), o del apilador unido al lector de placas (típicamente 25-50 placas). Recientemente hemos llevado a cabo un experimento QFA totalmente automatizado en 123 platos, cada uno con 308 cultivos experimentales, dando 37.884 cultivos simultáneos. Se estima que el número máximo posible de las culturas de cultivo independientes en el líquido es de 96 (cultivos / placa) x 50 (placas / apilador) = 4,800, que es de alrededor de diez veces menor que nuestro rendimiento QFA. Una alternativa para las pantallas de cultivo líquidos es utilizar muchas gro automatizadowth dispositivos en paralelo (Tabla 1 de la revisión de Blomberg 8), cada uno con una capacidad de uno o dos platos. El control de temperatura en cada dispositivo es independiente, y así que las condiciones no son idénticas, pero suponiendo que lo sean, este flujo de trabajo que requieren al menos 190 dispositivos de este tipo para que coincida con el rendimiento QFA (suponiendo 200 cultivos líquidos por dispositivo). En resumen, QFA es un flujo de trabajo de alta calidad que pueden ser útiles para obtener los caracteres cuantitativos de crecimiento en los dos pequeños experimentos a escala centrados y pantallas de alto rendimiento. Es lo suficientemente flexible para ser aplicado eficazmente con diferentes requisitos para el equipo robótico. El componente de cálculo del flujo de trabajo QFA se basa en libre disposición, el código fuente abierto.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> 96 pines manual de pintool con 1/8 pines de diámetro &quot; </td></tr><tr><td> Mezclar mate </td><td> Eppendorf </td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td> Beckman </td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td> Thermo Scientific </td><td> 50095890 </td><td> Instalado en Biomek FX </td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> BM3-SC </td><td> 192 plataforma giratoria del carrusel </td></tr><tr><td> spImager </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> spImager </td><td> Manual de imagen de alta resolución </td></tr><tr><td> spImager con Cytomen </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Costumbre </td><td> Temperatura controlada de imágenes automatizado de alta resolución </td></tr><tr><td> Cytomat 6001 con intercambiador de calor </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51022222 </td><td> Se adjunta a spImager </td></tr><tr><td> Ecoline RE207 </td><td> Lauda </td><td> RE207 </td><td> Se adjunta a Cytomat </td></tr><tr><td> spImager con el carrusel de </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Costumbre </td><td> Imagen automatizada de alta resolución </td></tr><tr><td> Pin Robot herramienta de accesorio para FP12pins </td><td> V &amp; P Científico </td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 x FP12 pines </td><td> V &amp; P Científico </td><td> FP12 </td><td> 50,4 mm de largo, 17 mm de longitud expuesta pin </td></tr><tr><td> Docking Station para la Herramienta de Pin </td><td> V &amp; P Científico </td><td> VP425 </td><td> Base de la estación de acoplamiento eliminado para permitir un secado de fans de los pasadores </td></tr><tr><td>Pin Cepillo de limpieza </td><td> V &amp; P Científico </td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> Herramienta manual pin </td></tr><tr><td> Nunc OmniTray con tapa </td><td> Nunc </td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 así estériles placas de poliestireno </td><td> Greiner BioOne </td><td> 655161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 así estériles tapas de poliestireno </td><td> Greiner BioOne </td><td> 656171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Reactivos específicos y equipos.

a quantitative fitness analysis workflow

Análisis de aptitud cuantitativa (QFA) es un flujo de trabajo experimental y computacional para la comparación de eficacias de los cultivos microbianos crecido en paralelo 1,2,3,4. QFA se puede aplicar a las observaciones de las culturas centradas individuales, pero es más útil para todo el genoma interacción genética o la investigación de análisis de drogas a miles de culturas independientes. El método experimental central es la inoculación de independientes, diluidas cultivos líquidos microbianos sobre discos de agar sólidos que son incubados y se fotografiaron con regularidad. Las fotografías de cada punto de tiempo se analizan, produciendo cuantitativos estimaciones de la densidad de células, que se utilizan para construir curvas de crecimiento, lo que permite medidas cuantitativas aptitud para ser derivado. Eficacias Cultura se puede comparar a cuantificar y clasificar las fortalezas genéticas de interacción o de sensibilidad a los medicamentos. El efecto sobre la aptitud cultivo de cualquier tratamiento añadido en agar sustrato (por ejemplo, pequeñas moléculas, antibióticos o nutrientes) o se aplica a placas externoly (irradiación UV, por ejemplo, temperatura) se puede cuantificar por QFA. El flujo de trabajo QFA produce tasa de crecimiento estima análoga a los obtenidos por medición espectrofotométrica de paralelas cultivos líquidos en los lectores de placas de 96 pocillos o bien 200. Es importante destacar que QFA tiene el rendimiento significativamente mayor en comparación con estos métodos. Culturas QFA crecer en una superficie de agar sólido y por lo tanto bien aireado durante el crecimiento sin la necesidad de agitación o agitación. QFA rendimiento no es tan alta como la de algunos matriz sintética genética (SGA) de los métodos de detección 5,6. Sin embargo, ya que las culturas están fuertemente QFA diluido antes de ser inoculadas en agar, QFA puede capturar las curvas de crecimiento más completos, incluyendo las fases exponencial y la saturación de 3. Por ejemplo, las observaciones de la curva de crecimiento permiten tiempos de la cultura de duplicación que se calcula directamente con la alta precisión, como se indicó anteriormente 1. Aquí les presentamos unaprotocolo específico de QFA aplicado a miles de S. culturas cerevisiae, que se gestionan automáticamente mediante robots durante la inoculación, incubación y de imagen. Cualquiera de estos pasos automatizados puede ser sustituido por un procedimiento equivalente, manual, con una reducción asociada en el rendimiento, y que también presentan un protocolo de instrucciones rendimiento más bajo. Las mismas herramientas de software QFA se puede aplicar a las imágenes capturadas, ya sea en flujo de trabajo. Tenemos amplia experiencia en la aplicación de QFA a los cultivos de la levadura de gemación S. cerevisiae, pero esperamos que QFA será igualmente útil para examinar las culturas de la levadura de fisión S. pombe y cultivos bacterianos.

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A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Análisis de aptitud cuantitativa (QFA) es una serie complementaria de los métodos experimentales y computacionales para la estimación de eficacias de cultivos microbianos. QFA estima el efecto de mutaciones genéticas, medicamentos u otros tratamientos aplicados en el crecimiento de microbios. Los experimentos de escala a partir del análisis de las culturas individuales enfocada a miles de culturas paralelas se pueden diseñar.

Un flujo de trabajo de Análisis Cuantitativo Gimnasio

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

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