Name: a quantitative fitness analysis workflow
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fitness Analysis Workflow at JoVE.com

Vi erkänner tacksamt alla medlemmar i vårt laboratorium och Centrum för integrerad System Biology of Ageing and Nutrition (CISBAN) för stöd och hjälpsamma diskussioner. Denna studie stöddes av bioteknik och Biological Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) och Wellcome Trust (075.294, 093.088).

Manuell QFA Protokoll (för S. cerevisiae stammar) 1. Odling av jäst-stammar <ol><li> Upp till 96 oberoende jäststammar odlades i 200 pl rika flytande media i en 96-brunnars odlingsplatta. Stammarna odlades till mättnad i en temperaturstyrd inkubator. </li><li> En 96 pin, 1/8 &quot;diameter manuell replik plater (SIGMA R-2508) steriliseras genom att först doppa repliken plater i 100% etanol, flammande och sedan lämnar svalna. </li><li> 200 | il sterilt vatten är anordnade i en 96-brunnars odlingsplatta. De mättade kulturerna vortexas (Eppendorf MixMate, 30 sek, 750 rpm) och späds genom att doppa steriliserade stiftet verktyget till mättade stammarna tre gånger sedan i plattan som innehåller vatten en gång. </li><li> Tappen verktyget omsteriliseras enligt 1,2. </li><li> Den steriliserade PIN verktyget används för att upptäcka den utspädda kulturen på sålda agarplattor genom att doppa i plattan som innehåller den utspädda kulturen tre gångern överför tappen verktyget till en rektangulär fast agarplatta. </li><li> De rektangulära fasta agarplattor inkuberas vid en lämplig temperatur innan den avbildas manuellt med en S &amp; P Robotics spImager. Alternativa image capture metoder kan också användas som en FujiFilm LAS4000, eller en billigare digital SLR kameran om omsorg vidtas för att säkerställa jämn belysning och konsekvent plattan positionering i förhållande till avbildning kameran. </li><li> Metoden kan anpassas till ett mindre antal parallella kulturer, såsom 48, vilka kan monteras på runda petri-skålar om man är noga med att säkerställa samma vinkel i förhållande till bildkamera under varje bild. </li></ol> Helautomatiserad QFA protokoll (för S. cerevisiae-stammarna) 2. Odling av jäst-stammar <ol><li> Starta med en rektangulär gruppering av oberoende jäststammar som växer på fast agar. I detta exempel börjar stammar är resultatet av korsande en temperaturkänsliga fråga mutation med jästen radering Collection (YDC) av Synthetic Genetisk Array (SGA). Slutliga SGA plattor är år 1536-format. Detta är 16 rader gånger 24 kolumner med kolonier / kulturer som representerar fyra replikat av 384 oberoende jäststammar. Se figur 1 för plattan layouter. </li><li> 384 stammar ut på 1536 överförs robot med en S &amp; P Robotics Inc. BH3-SC robot med en 96 tapp, 1-mm bendiametern steril pintool i fyra 96-brunnars odlingsplattor innehållande 200 | il av selektiva media (figur 1). Pintool renhet och sterilitet åstadkoms genom sekventiell tvättning i sterilt vatten två gånger (en gång med en roterande borste för att avlägsna skräp), 70% etanol (med sonikering) och slutligen 100% etanol. </li><li> Kulturerna odlades till mättnad (i tre dagar vid 20 ° C i detta exempel, se figur 1). </li></ol> 3. Spotting jästkulturer <ol><li> Med hjälp av en Beckman Biomek FX, mättade kulturerre återsuspenderades genom virvling på en Variomag Teleshake (moturs vid 1000 rpm under 20 sekunder) och späddes ungefär 1:70 genom att fästa in 200 pl sterilt vatten med användning av en steril 96 stift robotliknande stift verktyget (V &amp; P Scientific magnetisk montering pintool, 2 mm bendiametern). Pin verktyget renhet och sterilitet åstadkoms genom tvättning i sterilt vatten, tvättning i 70% etanol (med en borste för att avlägsna skräp) och slutligen doppning i 70% etanol följt av torkning. </li><li> Utspädda kulturer fläckig på fasta agarplattor i 384-format med samma robot PIN-kod verktyg (se figur 1) efter rengöring och sterilisering. </li><li> Efter nålning, är plattorna överfördes till en Cytomat temperaturkontrollerad, fuktad inkubator med automatisk karusellen och lucka. </li></ol> 4. Bildinsamling <ol><li> En S &amp; P Robotics automatiska kameran bort upprepade gånger plattorna från Cytomat inkubatorn, avlägsnar plattan locket, lägger dem just under en bifogad, jämnt belyst utrymme under en Canon EOS Rebel Ti 35mm DSLR, fångar en bild vid 5184 x 3456 px upplösning, ersätter plattan locket och returnerar dem till inkubatorn karusellen. En bild har tagits omedelbart efter inledande överföringen till inkubatorn för att möjliggöra en noll tidpunkt tillväxt mätning (bakgrund). Robot hantering och fotografering tar 2 minuter per platta. </li><li> Med en fullastad karusell, är den maximala uppnåbara plattan bildfångst frekvens en bild var sjätte timme. Plattorna inkuberas i upp till sex dagar (tills kolonitillväxt mättnad. Figur 1 visar tre typiska bilder från en tid-kurs vid 20 ° C. </li><li> För spårning ändamål plattorna namnges efter inkubator namn, temperatur, unika sekventiella batchnummer och position i inkubatorn. Image namn är en sammansättning av plåt namn och tidsstämpel och automatiskt konstrueras på Bildinsamling (t.ex. K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg, Filtyp FT1, Tabell 1). </li></ol> 5. Infångning av experimentell metadata De metadata filerna som beskrivs i detta avsnitt är tabbavgränsade textfiler som manuellt genereras (t.ex. med kalkylprogram). Den experimentella Beskrivning filen (FT2, tabell 1) är unik för varje experiment, men biblioteket Beskrivning (FT3, tabell 1) kan återanvändas i stor utsträckning en gång konstruerat. <ol><li> Försöket beskrivs i den experimentella Beskrivning filen (FT2, Tabell 1) med kolumner för streckkod (eller automatiskt genererade platta namn), experimentera start tidsstämpel, plåt behandling, innehållet av fast agar medium, skärmnamn, bibliotek, registreringsnummer (för bibliotek med flera plattor) och en upprepad kvadrant nummer (se figur 1) för att skala ner från 1536-format till 384-format. </li><li> Den jäststam biblioteket beskrivs med ett bibliotek Beskrivning fil (FT3, <strong&gt; Tabell 1) som anger genotypen odlas i varje kultur läge i varje platta av ett bibliotek. Den innehåller kolumner för: biblioteket namn, ORF, registreringsnummer, tallrik rad, kolumn på plattan och en valfri noter kolumn. </li><li> En valfri Standard Gene Namn fil (FT4, Tabell 1) som beskriver standarden genen namn (t.ex. RAD9) associeras med varje systematiskt ORF y-nummer (t.ex. YDR217C) identifiera stammar som kontrolleras kan tillhandahållas. Den här filen innehåller två kolumner: ORF &amp; Gene namn. </li></ol> 6. Dataanalys Den QFA beräkningsmässiga arbetsflödet kräver tillgång till en någorlunda kraftfull multicore datorarbetsplats (t.ex. en Dell Precision T3500 med Xeon quad-core 2,67 GHz-processor och 12 GB RAM) som är installerat Colonyzer bilden verktyget analysmjukvara 3,4 och QFA R-paketet 7 , vilka båda dokumenterade på nätet, är fritt tillgängliga och körs på en rad olika operativsystem. <ol><li>Springa Colonyzer med var och en av de infångade plattan bilder som insignal och genererar en fil Colonyzer utgång (FT5 tabell 1) för varje tagna bilden. Colonyzer utdatafiler ange uppskattningar kultur densitet, kultur område, form och färg för varje 384 platser på den avbildade plattan. Utgång filnamn automatiskt kopieras från källan bilden filnamnet (t.ex. plattan fotografiet K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1, tabell 1) motsvarar den Colonyzer utdatafilen K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat ( FT5, Tabell 1)). </li><li> Använda QFA R-paketet, ladda experimentell metadata (FT2, tabell 1) och Colonyzer filer utgång (FT5 tabell 1). Dessa data slås samman till R dataramar (som kan exporteras som QFA Raw Data textfiler FT6 (tabell 1)) för vidare analys. </li><li> Den QFA R Paketet innehåller funktioner för att samla timecourses celldensitet för varje kultur, för att passa allmän logistic befolkningen modeller till synpunkter och plot båda (se figurerna 2 och 3 för exempel). Monterade parametervärden skrivs till QFA Logistisk parameterfiler (FT7 tabell 1). Se QFA R-paketet dokumentationen för mer information. </li><li> Den QFA R Paketet innehåller också funktioner för kvalitetskontroll: kanten kolonier förkastas på grund av den större tillgången på näringsämnen på plattan kanterna och svårigheter med bildanalys i närheten tallrik väggar, kulturer som misslyckades SGA och genotyper visa koppling till screen-specifika markörgener tas bort från analysen. </li><li> Flera kvantitativa fitness åtgärder härrör från logistiska parametrar befolkningen modell för varje kultur. Dessa inkluderar maximisatser populationsfördubblingstid (MDR) och antalet divisioner från ympning till mättnad (MDP). För varje uppsättning likadana kulturer (unika genotyp till exempel) och för varje fitness definition flera sammanfattande statistik över fitness uppskattningar computdelade: medelvärde och median fitness, fitness standardavvikelse och antal replikat observerats. Sammanfattande statistik ut till QFA Fitness Sammanfattning filer (FT8, tabell 1) för vidare analys, till exempel beräkning av genetiska interaktion poäng (FT9 tabell 1). </li></ol> 7. Representativa resultat Figur 2 visar en typisk tillväxtkurva av 384 QFA kulturer växer vid 20 ° C på fast agar som kvantifierades genom Colonyzer, med ökning i celldensitet först har blivit detekterbar efter ungefär 2 dagar. Denna försening är sannolikt en kombinerad effekt av en kultur fördröjning fas efter inokulering på fast medium och en undre detektionsgräns för cell densitet. Figur 3 visar 308 liknande tillväxtkurvor tagna från en enda platta. Figur 4 visar en jämförelse av två Genomvid QFA skärmar att sluta genetiskainteraktion styrkor (anpassad från 1). Den QFA R Paketet 7 innehåller även funktioner för att producera figur 3 och mata rangordnade listor av undersökta genotyper och uppskattningar av genetiska samspel styrka (GIS), tillsammans med ett Q-värde (falskt Discovery Rate (FDR) korrigerat p-värde) för betydelsen av observerade GIS. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4018/4018fig1.jpg" /> Figur 1. Schema för robot ympning av jäststammar i 384-plats format. Detta förfarande börjar med 1536 oberoende kulturer per platta (vänster). I denna typiska exempel kolonier i positioner 1,1, 1,2, 2,1 och 2,2 (rött) är fyra replikat av samma genotyp his3 :: KANMX kulturer i gult, växer på kanten av plattan. har en tillväxt fördel på grund av bristande konkurrens och därför inte granskas av QFA. En av dessa upprepningar (t.ex. 1,1) ympas i flytande tillväxtmedium i 96-brunnars platta<html> s med användning av en 96-stifts verktyg som inoculates 96 av 1536 kolonier per gång. För att ympa ett replikat för varje 384 gendeletioner, fyra olika &quot;kvadranter&quot; (anges som röd, blå, grön och lila) inokuleras i fyra olika 96-brunnar innehållande tillväxt media. Efter tillväxt till mättnad (t.ex. 3 dagar vid 20 ° C), kulturerna späddes i vatten, sedan de fyra kvadranterna från en upprepning är fläckig i 384-format på en fast agarplatta (höger) i samma mönster som det ursprungliga SGA plattan (såsom indikeras av färg). Processen kan upprepas för att testa andra replikerar: 1,2; 2,1 och 2,2. Exempel tidsförlopp bilderna till höger fångades 0,5, 2 och 3,5 dagar efter inokulering. Anpassad från Kompletterande figur 1 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . 018/4018fig2.jpg &quot;/&gt; Figur 2. En enda robot-infångade QFA tillväxtkurva. A) QFA tillväxtkurvan för en jäststam som växer på agar innehållande galaktos vid 20 ° C. Bilder fångades robot ungefär var 2 timmar. Exponentiella fasen vid denna temperatur kunde observeras under ca 1,5 dagar, med kulturen densitetsökning först har blivit detekterbar ca 2 dagar efter inokulering. En generaliserad logistisk modell passar till observerade data (grå kurva). Modellparametrar automatiskt monterad av QFA R-paketet presenteras: K (bärförmåga (AU)), R (tillväxthastighet (d -1)), g (inokulat densitet (AU)), v (tillväxt symmetri). B) När det gäller panel A, plottade med cell densitet på en log-skala. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4018/4018fig3.jpg" /> Figur 3. Automatiskt genen<html> rankade tillväxtkurvor fångas parallellt från en enda 384-formatet plattan. Varje panel visar beräkningar celldensitet (röda kors) och modellen passar (svarta kurvor) för oberoende kulturer märkta av gen namn eller ORF y-nummer odlas i ett QFA förfarande. Detta exempel Plattan avbildas av roboten och odlades i en automatiserad inkubator vid 20 ° C. Experimentell metadata automatiskt ingår i figuren titeln: plåt namn, tallrik behandling agarmedium och bibliotek registreringsnummer. Anpassade modell parametervärden också automatiskt skrivs ut på varje panel (se figur 2). Edge kulturer bort från QFA analys lämnar 308 kulturer i denna kurva (se QFA Protocol 5,4). Eftersom kanten kulturer inte analyseras i QFA är dessa kultur platser vanligtvis fylld med neutrala kontroll stammar (pGAL-HIS3 i detta fall). Den ursprungliga versionen av denna figur är produktionen av QFA R-paketet i. Pdf-format och är därför oändligt zoombar och sökbar via text frågor.:/ / Www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig3.pdf &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicka här för att visa en större bild. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4018/4018fig4.jpg" /> Figur 4. Jämföra fitnesses från två QFA skärmar att härleda genetiska samspel. Detta diagram visar jämförelse av lämplighet spirande jäst deletioner (yfgΔ) i kombination med den neutrala ura3A mutationen eller temperaturkänsliga CDC13-1 mutationen och vuxit i semi-toleranta temperatur för CDC13- 1 (27 ° C). Fitness beräknades som produkten av maximala dubblering ränta och maximal fördubbling potential 1. De flesta deletionsstammar växa bra i kombination med den neutrala ura3A mutation, som förväntat och har hög fitness, men strykningar kombinerat med CDC13-1 har ett brett utbud av fitnesses. De ljusblå linjerna passerar the plats för neutrala his3Δ mutationen är den heldragna linjen en linjär regressionsmodell av genetisk självständighet (förväntad lämplighet CDC13-1 yfgΔ mutanter som ges lämplighet ura3A yfgΔ mutanter) och den streckade linjen är den linje lika kondition. Strykningar grön avsevärt förbättra konditionen defekt hos CDC13-1-stammar. Strykningar röd dämpa avsevärt samma defekt. Vertikalt avstånd av någon mutation CDC13-1 yfgΔ från den fasta linjen anger styrkan av genetiska samspel mellan CDC13-1 och yfgΔ under plattan förhållanden. Observera att en del av de starkaste suppressorer av CDC13-1 tidigare har identifierats checkpoint gener, RAD17, DDC1 och RAD24 och nukleas EXO1 nära toppen till höger. Gener vars borttagning minskar fitness inkluderar YKU80 (som kodar för DNA-reparation och telomer tak protein YKU80) nära<html> nere till höger. Observera också att vissa grupper av gener som fungerar tillsammans tenderar att samlokaliseras på denna tomt. Tre exempel kluster markeras i blått SPE1, SPE2 och SPE3: spermidin syntes gener, RAD17 och DDC1 och RAD24: komponenter som kodar för checkpoint glidande klämman och Checkpoint klämma lastare, MRE11, RAD50 och XRS2: den MRX komplexet, som deltar i DDR och EST1 &amp; EST3: gener involverade i telomerlängd reglering. Anpassad från Kompletterande figur 1B 1 kan rådata från vilken denna tomten genererades laddas ner härifrån: <a href="http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/" target="_blank">http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/</a> . <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig4.pdf" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . &quot;&gt; <tbody><tr><td> Fil-ID </td><td> Filtyp </td><td> Manuellt Konstruerad </td><td> Uppdateringsfrekvens </td><td> Förutsättning </td></tr><tr><td> FT1 </td><td> Plattan fotografi </td><td> Ingen </td><td> Per platta och tidpunkt </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT2 </td><td> Experimentell beskrivning </td><td> Ja </td><td> Per experiment </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT3 </td><td> Biblioteket Beskrivning </td><td> Ja </td><td> Per bibliotek </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT4 </td><td> Standardmetoder Gene Namn </td><td> Ja </td><td> Per bibliotek </td><td> Ingen </td></tr><tr><td> FT5 </td><td> Colonyzer-utgång </td><td> Ingen </td><td> Per tidpunkt per platta </td><td> Ja </td></tr><tr><td> FT6 </td><td> QFA Rådata </td><td> Ingen </td><td> Per experiment </td><td> - </td></tr><tr><td> FT7 </td><tD&gt; QFA Logistic Parametrar </td><td> Ingen </td><td> Per experiment </td><td> - </td></tr><tr><td> FT8 </td><td> QFA Fitness Sammanfattning </td><td> Ingen </td><td> Per experiment </td><td> - </td></tr><tr><td> FT9 </td><td> QFA Genetisk Interaktion Träfflistan </td><td> Ingen </td><td> Per GIS studie (2 expts.) </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Elektroniska QFA filer. Alla angivna filer (utom FT1) är tabbavgränsade textfiler och kan konstrueras eller läsa med någon textredigerare eller kalkylprogram. För ytterligare information om att bygga QFA metadata filer och exakt tolkning av QFA utgång se QFA R paketdokumentation 7 och Colonyzer dokumentationen till programvaran 3. <img src="/files/ftp_upload/4018/4018table2.jpg" alt="Tabell 2" /> Tabell 2. Metoder för bedömning av kultur fitness. En sammanfattning av funktionerna och kräverningar av ett antal metoder för att bedöma mikrobiell odling fitness. En översyn av Blomberg 8 innehåller mer detaljerad jämförelse av några av dessa. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018table2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> .

<ol>
	<li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects.">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362 (2011).</li><li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li><li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonyzer:+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar.">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li><li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping.">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li><li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70&#916;mutants.">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70&#916;mutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li><li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li><li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li><li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries.">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864 (2011).</li><li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants.">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li><li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+ecology:+The+social+side+of+wild+yeast.">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

QFA är i många avseenden en direkt ättling till tre etablerade bänk skala mikrobiologiska tekniker: kultur spädningsserie stickprov 9, tillväxtkurva beslutsamhet i luftade flytande kulturer 9 och replica plating 13. Dessa tre metoder sammanfattas och jämföres med QFA och andra storskaliga metoder i tabell 2. I spädningsserier stickprov definierar en stam lämplighet som dess förmåga att bilda kolonier i en serie av kulturer som odlats från en rad av inokulat spädningar att QFA åtgärder stam kondition genom att upprepade observationer av en enda kultur konstruera en tillväxtkurva. Kvantifiera fitness från enstaka kulturer ger många fler stammar som skall undersökas samtidigt under identiska förhållanden. Replikera matriser av kulturer gör upprepade tester av stam samlingar, mest användbart när man testar för skillnader kultur fitness i olika miljöer eller genetiska bakgrund. Den QFA protokoll presenteradesHär använder dyra robotar utrustning för att kopiera, inokulera, inkubera och bild agarplattor, lämplig för observation tillväxt av tusentals oberoende kulturer (robot QFA, tabell 2). Eftersom QFA bygger på etablerade, traditionella lab tekniker, kan det också göras betydligt billigare genom att ersätta robot hjälp med manuella steg (manuell QFA, tabell 2). Manuell QFA innebär replikation och ympning av kulturer på agarplattor med en manuell PIN-kod verktyg och manuell överföring av plattor till och från en inkubator för fotografering. Samma Beräkningsanalys arbetsflöde kan användas för att generera tillväxtkurvor från antingen experimentell design. QFA fitness uppskattningar verkar vara förhållandevis exakt. I figur 4, är de genomsnittliga fitnesses av fyra exempel kluster av funktionellt besläktade gendeletioner markeras. Närheten medlemmar i varje funktionellt relaterad gen klass i två oberoendeent genetisk bakgrund (ura3A och CDC13-1) indikerar reproducerbarhet QFA fitness uppskattningar. Till exempel, bara 3 gendeletioner (av möjliga 4300) isolerade de tre medlemmarna i det bevarade MRX komplex. High-throughput alternativ till QFA för testning tillväxtegenskaperna hos mikrobiella stammar innefattar SGA 5,6, konkurrens skärmar i Streckkodsformulär bibliotek 11,12 och skärmar som fångar optisk densitet kinetik i spektrofotometriska läsare plattan 10 som är sammanfattade i tabell 2 och beskrivs mera fullständigt på annan plats 8 . QFA och SGA plattor, där kulturer växer på fasta Agarytorna (agar metoder, tabell 2) kan hanteras snabbt och enkelt genom robot. Fasta agarytan kulturerna är väl luftas hela tillväxten och celler kan växa i fasta kulturer, så sällskapliga mikrober att växa i ett samhälle 14. Behåll, mikrobiella samhällen enffect egna mikromiljöer, toxiner utsöndrande såsom etanol, och eventuellt signalering mellan celler. Men kontinuerlig blandning av flytande kulturer, som krävs för att uppnå adekvat luftning, konstgjort stör mikrobiella samhällen och deras mikromiljöer som kan påverka deras sätt att tillväxt. Korskontaminering är mindre ett problem i fast agar metoder eftersom det är mindre möjlighet för vätskestänk bär celler mellan kulturer. Om kontaminering sker genom främmande luftburna mikrober i fast agar analyser, kan det ofta detekteras genom visuell inspektion av fasta agarplattor och redovisas eller avlägsnas. QFA genomströmningen är betydligt högre än för parallella flytande metoder på två sätt. Först av allt om QFA (och SGA) plattor, är ympade kulturerna packas tillsammans tätare, vilket ger flera oberoende kulturer per platta. I QFA finns normalt 308 kulturer, inte räknar icke-experimentella senaste kulturer (figur 1) comfört med parallella flytande kulturer med 96 eller 100 kulturer per platta. För det andra kan QFA experiment skalas till en mycket större antal plattor. Medan antalet plattor analyseras i en enda QFA försöket begränsas endast av det tillgängliga utrymmet i en inkubator eller varmt rum, den minsta tillåtna bildfångst frekvens och högsta uppnåeliga fånga frekvens är antalet plattor i en vätska tillväxt experiment starkt begränsat genom förmågan att plattläsare (typiskt en eller två plattor) eller av den travande fäst vid plattläsare (typiskt 25-50 plattor). Vi har nyligen genomfört en helautomatiserad QFA experiment på 123 plattor, var och en med 308 experimentella kulturer, vilket ger 37,884 samtidiga kulturer. Vi bedömer att maximalt uppnåeliga antal oberoende kulturer som växer i vätskan är 96 (kulturer / platta) x 50 (plattor / Staplare) = 4800, vilket är cirka tio gånger mindre än vår QFA genomströmning. Ett alternativ för flytande kultur skärmar är att använda många automatiserade GROwth enheter parallellt (tabell 1 från granskning av Blomberg 8), vardera med en kapacitet av en eller två plattor. Temperaturreglering i varje enhet är oberoende och därför förhållandena inte är identiska, men förutsatt att de är, skulle detta arbetsflöde kräver minst 190 sådana enheter för att matcha QFA genomströmning (förutsatt 200 flytande kulturer per enhet). Sammanfattningsvis är QFA en hög kvalitet arbetsflöde som kan med fördel tillämpas för att samla in kvantitativa tillväxt fenotyper i både små inriktade skala experiment och hög kapacitet skärmar. Det är flexibelt nog att kunna tillämpas effektivt med varierande krav på robot utrustning. Den beräkningsmässiga delen av QFA Arbetsflödet är baserat på fritt tillgängliga, öppen källkod.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens / utrustning </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> 96 stift manuell pintool med 1/8 &quot;diameter ha </td></tr><tr><td> Blanda Mate </td><td> Eppendorf </td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td> Beckman </td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td> Thermo Scientific </td><td> 50095890 </td><td> Monteras på Biomek FX </td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> BM3-SC </td><td> 192 hyllan roterande karusell </td></tr><tr><td> spImager </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> spImager </td><td> Högupplöst manuell avbildning </td></tr><tr><td> spImager med Cytomvid </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Anpassad </td><td> Temperaturstyrd automatiserad högupplösta bilder </td></tr><tr><td> Cytomat 6001 med värmeväxlare </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51022222 </td><td> Fäst spImager </td></tr><tr><td> Ecoline RE207 </td><td> Lauda </td><td> RE207 </td><td> Fäst Cytomat </td></tr><tr><td> spImager med karusell </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Anpassad </td><td> Automatiserad högupplösta bilder </td></tr><tr><td> Robot pin Verktygsaxel för FP12pins </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 x FP12 stift </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> FP12 </td><td> 50,4 mm lång, 17 mm utsätts benlängd </td></tr><tr><td> Dockningsstation för Pin Tool </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP425 </td><td> Dockningsstation basen bort för att möjliggöra fläkt torkning av stift </td></tr><tr><td>Pin Rengöringsborste </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> Manuell tapp verktyget </td></tr><tr><td> Nunc OmniTray med lock </td><td> Nunc </td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 väl sterila polystyrenplattor </td><td> Greiner BioOne </td><td> 655.161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 väl sterila polystyren lock </td><td> Greiner BioOne </td><td> 656.171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabell 3. Specifika reagens och utrustning.

a quantitative fitness analysis workflow

Kvantitativ Fitness Analys (QFA) är en experimentell och beräkningsvetenskap arbetsflöde för att jämföra fitnesses av mikroorganismkulturer odlade parallellt 1,2,3,4. QFA kan tillämpas på fokuserade observationer av enskilda kulturer men är mest användbar för Genomvid genetiska interaktion eller skärmar läkemedel utreder upp till tusentals oberoende kulturer. Den centrala experimentella metoden är ympning av oberoende, utspädda flytande mikroorganismkulturer på fasta agarplattor som inkuberas och regelbundet fotograferas. Fotografier från varje tidpunkt analyseras, vilket ger kvantitativa uppskattningar celltäthet, som används för att konstruera tillväxtkurvor, vilket tillåter kvantitativ kondition som skall härledas. Kultur fitnesses kan jämföras för att kvantifiera och rangordna genetiska samspel styrkor eller känsligheter läkemedel. Effekten på kulturen lämplighet eventuella behandlingar tillsätts i underlaget agar (t.ex. små molekyler, antibiotika eller näringsämnen) eller appliceras på plattor externly (t.ex. UV-bestrålning, temperatur) kan kvantifieras genom QFA. Den QFA arbetsflödet producerar tillväxt beräknar analoga med de som erhållits genom spektrofotometrisk mätning av parallella flytande kulturer i 96-brunns-eller 200-brunnars platta läsare. Viktigare är QFA signifikant högre genomströmning jämfört med sådana metoder. QFA kulturer växa på ett fast agar yta och är därför väl luftas under tillväxt utan behov av omrörning eller skakning. QFA genomströmningen är inte så hög som den hos vissa syntetiska genetiska Array (SGA) screeningmetoder 5,6. Eftersom QFA kulturer kraftigt späds innan de ympas på agar, kan QFA fånga mer kompletta tillväxtkurvor, inklusive exponentiell och faser mättnad 3. Till exempel tillväxtkurva observationer tillåter kultur fördubbling tider uppskattas direkt med hög precision, som diskuterats tidigare 1. Här presenterar vi enspecifika QFA protokoll tillämpas på tusentals S. cerevisiae kulturer som automatiskt hanteras av robotar under ympning, inkubation och bildhantering. Alla dessa automatiska steg kan ersättas av en likvärdig, manuell procedur med en tillhörande minskning av kapacitet, och vi presenterar en lägre protokoll genomströmning manual. Samma QFA mjukvaruverktyg kan tillämpas på bilder tagna i någon arbetsflöde. Vi har lång erfarenhet av att tillämpa QFA till kulturer av den spirande jästen S. cerevisiae men vi förväntar oss att QFA kommer att vara lika användbar för att undersöka kulturer fissionsjäst S. pombe och bakteriekulturer.

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fitness Analysis Workflow at JoVE.com

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Kvantitativ Fitness Analys (QFA) är en kompletterande serie experimentella och beräkningsmässiga metoder för att skatta mikrobiella kultur fitnesses. QFA beräknar effekten av genetiska mutationer, läkemedel eller andra behandlingar appliceras på mikrob tillväxt. Experiment skalning från fokuserad analys av en enda kultur tusentals parallella kulturer kan utformas.

En kvantitativ Fitness analys Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Kvantitativa Phosphoproteomics i Fatty Acid Stimulerade Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging och kvantitativ analys av embryonala epitelceller i Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Kvantitativa levande celler fluorescens-mikroskopi Analys av fissionsjäst

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Kvantitativ analys av Random migration av celler med Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Kvantitativ analys av Autophagy med Advanced 3D Fluorescensmikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

En hög genomströmning MHC II-bindningsanalys för kvantitativ analys av peptidepitoper

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

En ny teknik för kvantitativ analys av håravfall hos möss Använda gråskala Analys

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Komplett arbetsflöde för analys av Histon posttranslationella modifieringar med botten upp masspektrometri: Från Histon Extraction till dataanalys

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.