Name: generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model
Uploaded: 2012-08-29T13:00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model at JoVE.com

وأيد هذا البحث من قبل جمعية الألمانية للبحوث DFG تحت رقم FO منحة 315/4-1 وDFG SFB 688.

1. عزل Microvessels الدماغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل إعداد 09:55 استخدام الفئران حديثي الولادة من كلا الجنسين (3-5 يوما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء ماوس وفقا لتوصيات IACUC / طبيب بيطري محلي، وإزالة الدماغ على الفور، ونقل إلى طبق بتري تحتوي على الحل التالي: ملي Hepes 15 (درجة الحموضة 7.4)، 153 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5.6 ملي بوكل، 2.3 ملي CaCl 2 × 2H 2 O، 2.6 ملم MgCl 2 × 6H 2 O، 1٪ (وزن / حجم) BSA (يشار إليها فيما يلي العازلة الجديدة بوصفها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما لم يذكر خلاف ذلك، ينبغي أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات العزلة في درجة حرارة الغرفة (RT) (22-24 ° C) تحت غطاء محرك السيارة الصفحي تدفق. قطع العقول (المخ المخيخ ودون جذع الدماغ)، بعد إزالة السحايا والأجزاء الشعرية، في المخزن المؤقت A باستخدام مشرط معقم. ماصة الأنسجة شظايا صعودا وهبوطا باستخدام ماصة 10 مل حتى لا تظهر كتل. نقل التعليق في أنبوب 50 مل الصقر وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق في RT. </li></ol> ملاحظة: يمكن تحديد السحايا والأغشية، رقيقة شفافة على سطح أنسجة المخ. يمكن إزالتها بعناية مع ملقط معقم. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل بيليه في المخزن المؤقت مل 4.5 (أ) مع 1.5 مل من 0.75٪ (W / V) كولاجيناز / dispase (روش) واحتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي (الهز أحيانا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه، وإعداد لوحات 12-طلاء جيدا من قبل أربعة آبار مع الكولاجين IV (0.1 ملغ / مل يتم إذابتها في حامض الخليك 50 ملم). السماح للانضمام لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف عملية الهضم من خلال إضافة 15 مل من الجليد الباردة العازلة إعادة تعليق بيليه A. بدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 250 تعليق XG لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة المايلين، إضافة 10 مل 25٪ (W / V) BSA (سيغما، الطهارة&gt; 98٪) وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة في C. ° 4 يجب ان يحل 25٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X (PAA المختبرات) وتمت تصفيتها من خلال ميكرون و 0،2إلتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية تجاهل طاف، حل بيليه في المخزن المؤقت مل 10 A ونقل إلى أنبوب فالكون الجديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 250 تعليق XG لمدة 5 دقائق في RT. بيليه الناتج على الخلايا البطانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل ضعف الكولاجين IV-12-المغلفة جيدا مع لوحة PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في 4 مل من المتوسط ​​النمو (DMEM تحتوي على 10٪ FCS والبنسلين 50U/ml / الستربتوميسين، 1٪ الجلوتامين L-) وتعليق لوحة الخلية في بئرين، 2 مل إلى كل بئر. إضافة إلى بوروميسين تركيز النهائي من 4 ميكروغرام / مل واحتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية في خلية حاضنة الثقافة. تسمح هذه الخطوة إزالة الخلايا بسرعة الانضمام ملاحظة: يتم إضافة بوروميسين لمدة 24 ساعة. يمكن فقط ECS الدماغ استقلاب ذلك، لأنواع الخلايا الأخرى بوروميسين سامة 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل متوسطة 2 مل تحتوي على خلايا غير الالتزام من الخطوة 1،14 في بئرين الطازجة (هذه الآبار تحتوي على جزء EC). تملأ الآبار مع الخلايا الالتزام من الظريفف مع 1،14 المتوسطة 2 مل الطازجة (هذه الآبار تحتوي على أنواع أخرى من الخلايا، الخلايا الليفية على سبيل المثال، الخلايا النجمية ويمكن زراعتها في نفس الوقت وتستخدم لمقارنات بين التشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسطة في اليوم التالي. </li></ol> 2. تخليد الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة GP + E-86 الجدد (GPENeo) 15 الليفية، إفراز فيروس النسخ المتماثل التي تعاني من نقص الجين الورمي مع تورام T الأوسط في المتوسط ​​تحتوي على 10٪ DMEM للحرارة المعطل FCS، 50U/ml البنسلين / الستربتوميسين، و 2 ملغ / مل G418 ( . PAA المختبرات) في قوارير المغلفة الجيلاتين ملاحظة: تورام الجين الورمي يسبب T الأوسط ترنسفكأيشن ميزة نمو ECS أكثر من ECS غير أحادي الطبقة مما يؤدي إلى متجانسة من الخلايا البطانية مع مورفولوجيا 4 إلى 6 أسابيع من الثقافة. GPENeo غير متوفرة تجاريا ويمكن الحصول على كمادة عامة مشتركة (يرجى الرجوع إلى منشورات الأصلي 4،16). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستخدام وسيلة الفيروسات المحتوية على<html> تخليد، زراعة الخلايا GPENeo في G418 خالية المتوسطة لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 10 مل من طاف وإضافة GPEneo Polybrene (hexadimethrine بروميد) (سيغما) إلى تركيز النهائي من 8 ميكروغرام / لتر، 0،45 ميكرون من خلال تعقيم فلتر لإزالة شظايا الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة النمو من الثقافات EC أعد الجزء 1 وإضافة 2 مل من خليط طاف / Polybrene GPEneo في الآبار. تكراره في اليوم التالي باستخدام الطازجة GPEneo طاف / Polybrene خليط ملاحظة: يستخدم لجعل المسام Polybrene في جدار الخلية لتسهيل العدوى مع الجسيمات الفيروسية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف / Polybrene GPEneo خليط في اليوم التالي، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني والحفاظ على الخلايا في النمو المتوسطة تغييرها كل 3 أيام. على التقاء، وتقسيم الخلايا على لوحات 01:02 IV-المغلفة الكولاجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عادة، ينبغي الحصول الدماغي البطانية مستقرة خطوط الخلايا (cEND) 4-5 أسابيع في وقت لاحق. </li></ol>ه &quot;&gt; 3. زراعة خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ غشائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد في الخلايا من cryoaliquot في حمام مائي ونقل في 15 ML-فالكون المتوسطة مع 10 مل قبل تحسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 250 تعليق XG لمدة 5 دقائق في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة، نقل بيليه في الرابع الكولاجين مطلية T 25 سم 2 قارورة الثقافة الخلية مع متوسط ​​النمو قبل تحسنت (كثافة الخلية لطلاء يجب ان تكون على الاقل 1X 10 4 خلايا / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسطة في اليوم التالي وصلت بعد التقاء خلايا (عادة بعد 5 أيام) تقسيم الخلايا. </li></ol> 4. تقسيم خلايا cEND (ملاحظة: يجب أن يتم تقسيم مرة واحدة في الأسبوع، تجنب تقسيم العالي من 1:4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 3 مل من محلول التربسين EDTA-الدافئة (PAA المختبرات) (T 75 سم 2 قارورة)، احتضان عند 37 درجة مئوية والانتظار حتى يتم تفريق الخلايا طبقة (عادة في غضون 5 إلى 15 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل سو المتوسطة النمو، ماصة صعودا وهبوطا، ونقل إلى الكولاجين الجديد IV-المغلفة القارورة. </li></ol> 5. تجميد خلايا cEND <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على تعليق خلية كما هو موضح في الخطوة 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 250 تعليق XG لمدة 5 دقائق في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه الخلية (التي تم الحصول عليها من 1 T 75 قارورة 2 سم) في 6 مل المتوسطة تجميد (95 متوسطة النمو٪، 5٪ DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم الخلية إلى أربعة التعليق ملاحظة 1.5 مل البرد مأخوذة: يمكن المصنف واحد البرد قسامة في 25 قارورة T 2 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين بالتبريد تحت مأخوذة-النتروجين السائل بخار في درجة الحرارة. </li></ol> cEND المتوسطة النمو: 450 مل DMEM، FCS 10٪، 10 مل الجلوتامين L-، 2٪ MEM-كيت، 2٪ NEAA، صوديوم 10 مل البيروفات، 50 U / مل البنسلين / الستربتوميسين 6. ممثل النتائج وتميزت الخلايا cEND وcerebEND من immunostainings من البطانية علىالثانية BBB وضع العلامات وكذلك قياسات المقاومة الكهربائية transendothelial (طير) والنفاذية. وكان cEND cerebEND على التشكل مماثلة على الثقافات الرئيسي لECS الدماغ، مع monolayers من الخلايا معبأة بإحكام ممدود أن عرضت في تثبيط نمو التقاء. وأعرب الخلايا المستويات التي يمكن اكتشافها جيدا claudin-5 occludin، والبروتينات VE-كادهيرين التي مترجمة في تقاطعات خلية خلية، كما هو موضح من قبل المناعي (الشكل 3) 4،5. الخلايا cEND زراعة في المصل انخفاض المتوسط ​​أدى إلى زيادة في طير (من 150 Ωcm 2 في وجود 10٪ المصل إلى 2 Ωcm 500 في وجود 2٪ مصل)، الذي potentiated بإضافة الهيدروكورتيزون (800 Ωcm 2) أو الأنسولين (1،000 Ωcm 2) 4 كان من Monolayers cEND المستزرعة في المصل انخفاض المتوسطة لمدة 21 يوما طير من 900 Ωcm 2 (الشكل 4). وقد تم قياس طير باستخدام الجمعيةتحتوي على أقطاب كهربائية الجاري فاة والجهد قياس-(أدوات دقيقة العالمي). على سبيل المقارنة، تم الإبلاغ عن الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الأولية ECS لديها قيم طير من 200-600 Ωcm 2 و خلية الفأر المتاحة تجاريا خط bEnd.3 كان طير قيم 100-140 Ωcm 2 (انظر للمراجعة الأخيرة أبوت 2005 وآخرون توث آل.، 2011 17،18). وبالإضافة إلى ذلك، انخفض مرور الجزيئات، مثل المنظمات غير المشحونة FITC-dextrans من الجماهير الجزيئية 4 و 10 و 70 و كيلو دالتون 500، أو فلوريسئين (300 دا) عبر أحادي الطبقة من cEND في المتوسط ​​2٪ FCS التمايز أكثر من 4 ساعة مقارنة مع الخلايا السيطرة الحفاظ على النمو في وسط يحتوي على 10٪ FCS: تم تخفيض تدفق paracellular إلى 30٪ من الخلايا الرقابة على فلوريسئين، إلى 26٪ للFITC-dextrans 10 و كيلو دالتون 70، وانخفض تدفق إلى 4.5٪ من الخلايا الرقابة على FITC 500 كيلو دالتون، dextrtan. كان نفاذية مماثلة لطير القيم، على أدنى مستوى في الخلايا المستزرعة في وجود الحلاوةocorticoids (GC) 4. في دراسات أخرى، حددنا الجينات المستهدفة جلايكورتيكود، occludin، claudin 5-VE-كادهيرين والبطانة في الدماغ الوعائية 4،7،9. أدى GC العلاج إلى زيادة في التعبير عن هذه البروتينات وإلى إعادة ترتيب كادهيرين-VE إلى الهيكل الخلوي. المباشرة بوساطة GC تنظيم محكم تقاطع البروتينات occludin وclaudin 5-يظهر من خلال عناصر استجابة GC في مناطق المروج لها 4،7،19. بالإضافة إلى ذلك، claudin-5 تم تحديد كهدف رواية الاستروجين في 10 البطانة الوعائية. وراء ضعف البطانية أمراض مختلفة كثيرة. نحن مثقف وcEND تحت الأوكسجين / الجلوكوز الحرمان (OGD) الظروف. أدى OGD إلى تعطيل وظيفة BBB، والتي يمكن اعادة بعد العلاج المشترك مع GC وproteasome بورتيزوميب المانع 12. أدت الظروف OGD إلى زيادة كبيرة في امتصاص الجلوكوز في التعبير ونقل القوارب من الجلوكوزالنسب في cerebEND، التي يمكن أن تكون مخففة من خلال إضافة MK801، مثبط غير التنافسية للمستقبلات NMDA 13. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> الشكل 1. واتخذت مورفولوجية خلايا المخ البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) بعد أسبوع واحد العزلة. صور المجهر الضوئي تحت التكبير (B) 6X (A) و15X. المستعمرات الجزيرة تتكون من الخلايا البطانية مرئية. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> الشكل 2. واتخذت مورفولوجية خلايا المخ البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) بعد شهر واحد العزلة وتخليد. صور المجهر الضوئي تحت التكبير 15X. ويمكن ملاحظة A، متجانسة متموجة أحادي الطبقة الخلايا البطانية. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> الشكل 3. خلد الدماغ microvasculكانت تزرع الخلايا البطانية ع صريحة claudin-5، وoccludin VE-كادهيرين. الخلايا CEND على coverslips المغلفة IV-الكولاجين وملطخة أجسام مضادة ضد claudin-5 (A)، occludin (B) وVE-كادهيرين (C). تم نقل الصور باستخدام المجهر زايس Axioscop2 تحت التكبير 40X. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> الشكل 4. كانت تزرع قياس المقاومة الكهربائية transendothelial (طير) من cEND CEND. أحادي الطبقة على مرشحات الكولاجين IV-transwell المغلفة (المسام حجم 0.4 ميكرومتر). بعد التوصل التقاء، واستمرت الخلايا في المتوسط ​​تحتوي على FCS 2٪. وقد تم قياس طير بعد أيام 7 و 14 و 21 باستخدام أقطاب كهربائية تحتوي على الجمعية الحالية، ومرور الجهد القياس.

<ol>
	<li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier.">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113 (2011).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier.">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937 (2008).</li><li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872 (2005).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).</li><li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli.">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37 (2006).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific.">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).</li><li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter.">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19 (2009).</li><li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND.">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937 (2007).</li><li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells.">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139 (2008).</li><li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium.">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298 (2010).</li><li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis.">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293 (2010).</li><li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome.">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081 (2011).</li><li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen/glucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells.">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44 (2012).</li><li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279 (2005).</li><li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells.">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203 (2002).</li><li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+function+of+the+blood-brain+barrier:+incomplete+presentation+of+protein+(auto-)antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro.">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757 (1990).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CNS+barriers:+evolution,+differentiation,+and+modulation.">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5 (2005).</li><li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery.">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107 (2011).</li><li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element.">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39 (2008).</li><li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses.">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125 (1994).</li><li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases.">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100 (1994).</li><li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation.">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327 (2001).</li><li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521 (1990).</li><li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells.">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101 (1994).</li><li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435 (1990).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315 (2010).</li><li>Skaper, S. D., Conn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neurosciences. 2, 1303 (1990).</li><li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin,+an+endothelial+anticoagulant+protein,+is+absent+from+the+human+brain.">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362 (1986).</li><li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis.">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540 (2003).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ويمكن استخدام الإجراء الموضح لعزل سلالات من الاوعية الدموية الدقيقة ECS الماوس المختلفة وكذلك من مختلف سلالات الفئران ضرب المغادرة لدراسة التغيرات في وظيفة محددة البطانة الوعائية. كوسيلة من وسائل تخليد استخدمنا التحول مع oncoprotein من الفيروسة التورامية الفئران، تورام المستضد T الأوسط. فإنها تحول بسرعة الخلايا البطانية غير ناضجة في الجسم الحي في المختبر و20،21،22. وسائل أخرى للتخليد ECS هو موضح في الأدب تشمل على سبيل المثال تخليد مع المستضد T SV40 كبيرة من الفيروس قردي 40 23 المفجي، منتج الجين اتش E1A 24 أو overexpression من الوحيدات الحفاز تيلوميراز الإنسان 3. تخليد مع PymT هو محددة لاظهار الدعم للالفئران غير ناضجة، والذي يسمح الحصول على ثقافة متجانسة من الفئران EC حديثي الولادة في وقت قصير. تخليد تغيير خصائص الخلايا واليجب مقارنة نتائج ه تم الحصول عليها مع خطوط الخلايا خلد سواء مع الخلايا الأولية أو مع التجارب المجراة على الفئران. وقد وصفت PymT EC خلدت للتعبير عن مستويات عالية من النشاط fibrinolytic والناتجة عن زيادة إنتاج المنشط البلازمينوجين يوروكيناز من نوع وانخفض إنتاج مثبطات منشط البلازمينوجين 25. المقارنة المباشرة لPymT خلد bEND5 خط الخلية الأولية مع ECS كشفت أن كلا من النماذج في المختبر BBB هي مناسبة تماما للدراسات التصاق الخلايا T 26. يمكن استخدام خطوط الخلايا التي أنشئت وفقا للإجراء المبين في رقم مرور منخفضة للحفاظ على خصائص الحاجز بواسطة التعبير عالية من البروتينات وBBB EC موصلي، كما تفقد الخلايا هذه الخصائص خلال الشيخوخة. هكذا بعد فقدان خصائص الحاجز، ينبغي النظر في إعداد خط خلية جديدة. يجب أن تكون الخلية كثافة الطلاء عالية لاظهار الدعم، وهذا أمر بالغ الأهمية لانتشار الخلايا. يجب النظر في هذا الإجراء خلال العزلة وكذلك الحفاظ على ECS خلد. وينبغي اختبار كل سطر الخلية الجديدة لخصائص الجدار وللملوثات محتملة مع أنواع الخلايا الأخرى. يمكن ملطخة monolayers EC مع مستضد العضلات المضادة للغالاكتوسيريبروزيد والبروتين لييفي الحمضية المضادة للالدبقية ومكافحة سلس والأجسام المضادة الأولية لاستبعاد التلوث مع الخلايا النجمية، وoligodendrocytes قد pericytes 4،27. استبعاد التلوث الأوعية الدموية meningal، يمكن اختبار التعبير عن thrombomodulin، وهو ما يعبر عنه في كل أسرة الأوعية الدموية باستثناء الدماغ 28. ومن المثير للاهتمام، وخلد خطوط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة المعزولة من مناطق الدماغ المختلفة تختلف في خصائص الجدار والتعرض للمؤثرات الموالية للالتهابات. وكمثال على ذلك، يمكن ذكر الدماغي خلية cerebEND cEND والمخيخ خطوط 4،5. وأظهرت CerebEND، مقارنةلcEND، وانخفاض مستويات التعبير عن مكونات رئيسية تقاطع ضيق claudin-1 وoccludin. ومع ذلك، كانت مستويات claudin-3 -12 وأعلى في cerebEND. عانى وظيفة الحاجز من الخلايا cerebEND أكثر من ذلك بكثير تحت العلاج مع الوسيط التهابات، TNFα من خصائص الجدار من الخلايا cEND فعلت 5. ويمكن ملاحظة ضعف أعلى المخيخ للمؤثرات التهابات، في الجسم الحي في مرضى التصلب المتعدد ولها في حيوانات التجارب الذاتية التهاب الدماغ و النخاع نموذج 29. هذه النتائج مثيرة للاهتمام تظهر ضرورة توليد وتميز الفرد نماذج في المختبر لمناطق الدماغ المختلفة، من أجل تحسين استهداف المستقبل المخدرات في الدماغ.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري (BSA) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A7906 </td><td> الطهارة&gt; 98٪ </td></tr><tr><td> الكولاجين IV </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C5533 </td><td> 50 ميكروغرام / مل في حمض الخليك 50 ملم </td></tr><tr><td> كولاجيناز / Dispase </td><td> روش </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> الجنين مصل العجل (FCS) </td><td> PAA المختبرات </td><td> A15110-1333 </td><td> تركيز النهائي 10٪، للحرارة المعطل (30 دقيقة عند 56 ° C) </td></tص&gt; <tr><td> الجلوتامين L- </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> التخزين: -15 ° C ≤ </td></tr><tr><td> MEM فيتامين </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> التخزين: -15 ° C ≤ </td></tr><tr><td> NA-البيروفات </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> النيوميسين (G418) </td><td> PAA المختبرات </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> غير الأحماض الأمينية الأساسية (NEA) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> تخزين عند 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilin / الستربتوميسين </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> التخزين: -15 ° C ≤ </td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene (hexadimethrine الميثيل) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 107689 </td><td> 0.8 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني، والتخزين في -20 ° C </td></tr><tr><td> بوروميسين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> التربسين / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0.05٪، 0.02٪ EDTA في برنامج تلفزيوني </td></tr></tbody></table>

generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model

الخلايا الظهارية والبطانية (EC) وبناء الحواجز التي تحمي paracellular الأنسجة من البيئة الخارجية والداخلية. حاجز الدم في الدماغ (BBB)، ويتألف من EC، نجمية نهاية أقدام pericytes، والغشاء القاعدي هو المسؤول عن الحماية والتوازن للحمة الدماغ. في المختبر هي نماذج BBB الأدوات المشتركة لدراسة بنية ووظيفة BBB على المستوى الخلوي. وقد تم إنشاء عدد كبير من مختلف النماذج في المختبر BBB للبحوث في مختبرات مختلفة حتى الآن. عادة، يتم الحصول على الخلايا من الأبقار، الخنازير، الفئران أو الماوس أنسجة المخ (نوقشت بالتفصيل في الاستعراض الذي فيلهلم وآخرون. 1). عينات الأنسجة البشرية لا تتوفر إلا في عدد محدود من المختبرات أو الشركات 2،3. بينما الخلية الأولية هي الاستعدادات تستغرق وقتا طويلا ويمكن أن تختلف الثقافات EC من دفعة لدفعة، وإنشاء خلد EC لينES هو محور الاهتمام العلمي. هنا، نقدم طريقة لإنشاء خط خلد الدماغ EC الاوعية الدموية الدقيقة من مخ الفأر حديثي الولادة. وصفنا الإجراء خطوة بخطوة قائمة الكواشف والحلول المستخدمة. وبالطريقة المحددة من قبل المختبر يسمح للعزلة ومتجانسة خلد خط الخلية البطانية في غضون أربعة إلى خمسة أسابيع. الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ خطوط الخلايا البطانية ووصف cEND 4 (من القشرة المخية) وcerebEND 5 (القشرة المخيخية من)، تم عزل وفقا لهذا الإجراء في المختبر فورستر واستخدمت على نحو فعال لشرح مختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية في BBB. وباستخدام cEND cerebEND لقد أثبتنا أن هذه الخلايا تستجيب ل4،6-9-جلايكورتيكود والاستروجين علاج 10 كما كذلك لصالح infammatory سطاء، مثل TNFalpha 5،8. وعلاوة على ذلك، درسنا في علم الأمراض من SC متعددةlerosis 11 و 12،13 نقص الأكسجة على مستوى EC-. يمكن اعتبار cEND وخطوط cerebEND كأداة جيدة لدراسة بنية ووظيفة الردود وBBB الخلوية من ECS للمؤثرات مختلفة أو تفاعل مع الخلايا اللمفية أو EC الخلايا السرطانية.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model at JoVE.com

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

هذه الطريقة يصف كيفية عزل خلايا بطانية وخلد الاوعية الدموية الدقيقة من مخ الفأر. وصفنا بروتوكول خطوة بخطوة بدءا من تجانس أنسجة المخ، والخطوات الهضم، والبذر وتخليد للخلايا. عادة، يستغرق حوالي خمسة أسابيع للحصول على متجانسة، خلدت الاوعية الدموية الدقيقة خط الخلية البطانية.

جيل من الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الفئران مخلد الخط الخلية البطانية باعتبارها<em&gt; في المختبر</em&gt; حاجز الدم في الدماغ الموديل

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

عزل خلايا الدماغ الأولية الفئران الاوعية الدموية الدقيقة غشائي

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

تفاعل الثقافات 3D المهندسة العصبية لمايكرو الكهربائي صالحة: مبتكر<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج تجريبي

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

في فيفو حاجز الدم في الدماغ نفاذية مقايسة في الفئران باستخدام المسمى فلوريسسينتلي تتبع

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

تقييم في فيفو لتعطيل حاجز الدم في الدماغ في نموذج الفئران من السكتة الدماغية

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

نموذج قبل السريرية لتقييم تعافي الدماغ بعد السكتة الدماغية الحاده في الفئران

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

الموجات فوق الصوتية المركزة التي تحفز فتح الحاجز الدموي الدماغي لاستهداف هياكل الدماغ وتقييم التعديل العصبي الكيميائي الوراثي

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

نباتات القوقعة الكاملة لحديثي الولادة كنموذج في المختبر

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

تسجيل السلامة الوظيفية للحاجز على bEnd.3 الخلايا البطانية الوعائية عبر اكتشاف المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

إعادة بناء الحاجز الدموي الدماغي في المختبر لنمذجة الأمراض العصبية واستهدافها علاجيا

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...