Name: generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model
Uploaded: 2012-08-29T13:00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG under tilskud nummer FO 315/4-1 og DFG SFB 688.

1. Isolering af Brain mikrokar <ol><li> For hvert præparat bruger 5-10 neonatale mus af begge køn (3-5 dage gamle). </li><li> Aflive en mus i overensstemmelse med lokale IACUC / dyrlæge anbefalinger, fjernes hjernen umiddelbart, og overføres til en petriskål indeholdende den følgende opløsning: 15 mM Hepes (pH 7,4), 153 mM NaCI, 5,6 mM KCI, 2,3 mM CaCl2 x 2H 2 O, 2,6 mM MgCl2 x 6H 2 O, 1% (vægt / vol) BSA (herefter benævnt puffer A). </li><li> Medmindre andet angives, skal alle isoleringsmetoder udføres ved stuetemperatur (RT) (22-24 ° C) under laminært stinkskab. Skær hjerner (cerebrum uden cerebellum og hjernestamme), efter fjernelse af meninges og kapillære fragmenter, i puffer A under anvendelse af en steril skalpel. Afpipetter den vævsfragmenter op og ned ved hjælp af en 10 ml pipette indtil der ikke klumper vises. Overfør suspensionen til et 50 ml Falcon-rør og centrifugeres ved 250 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. </li></ol> Bemærk: meninges kan identificeres som tynde, transparente membraner ved overfladen af hjernevævet. De kan fjernes forsigtigt med en steril tang. <ol start="4"><li> Supernatanten kasseres. </li><li> Pellet opløses i 4,5 ml buffer A med 1,5 ml 0,75% (vægt / vol) collagenase / dispase (Roche) og inkuberes i 45 minutter ved 37 ° C i et vandbad (lejlighedsvis rystning). </li><li> I mellemtiden fremstille de 12-brønds plader ved at overtrække fire brønde med collagen IV (0,1 mg / ml opløst i 50 mM eddikesyre). Tillad at adhærere i 1 time. </li><li> Stop fordøjelse ved tilsætning af 15 ml iskold buffer A. Pellet resuspenderes grundigt. </li><li> Centrifugér suspensionen ved 250 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Supernatanten kasseres. </li><li> For at fjerne myelin, tilsættes 10 ml 25% (w / v) BSA (Sigma, renhed&gt; 98%) og centrifugeres ved 1.000 x g i 20 min ved 4 ° C. 25% BSA bør opløses i 1 x PBS (PAA Laboratories) og filtreret gennem 0,2 pm filter). </li><li> Forsigtigt supernatanten, pellet opløses i 10 ml puffer A og overføres til en ny Falcon-rør. </li><li> Centrifugér suspensionen ved 250 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Den resulterende pellet indeholder endothelcellerne. </li><li> Vaskes to gange kollagen IV-overtrukne plade med 12 brønde med PBS. </li><li> Pellet resuspenderes i 4 ml vækstmedium (DMEM indeholdende 10% FCS, 50U/ml penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin) og pladen cellesuspensionen i to brønde, 2 ml til hver brønd. Tilsæt puromycin til en slutkoncentration på 4 ug / ml og inkuberes i 45 minutter ved 37 ° C i en cellekultur inkubator. Dette trin tillader fjernelse af hurtigt adhærerende celler Note:. Puromycin tilsættes i 24 timer. Kun hjernen EC&#39;er kan metabolisere det, for andre celletyper puromycin er giftigt 14. </li><li> Overfør 2 ml medium indeholdende ikke-adhærerede celler fra trin 1,14 i to nye brønde (disse brønde indeholder EF-fraktionen). Fyld op brøndene med klæbede celler fra step 1,14 med 2 ml frisk medium (disse brønde indeholder andre celletyper, fx fibroblaster, astrocytter og kan dyrkes parallelt og anvendes til sammenligning af morfologi). </li><li> Skift mediet den følgende dag. </li></ol> 2. Udødeliggøre Brain mikrovaskulære endotelceller <ol><li> Dyrke GP + E-86 Neo (GPENeo) 15 fibroblaster, udskiller en replikations-deficient virus med polyoma midterste T-onkogen i DMEM medium indeholdende 10% varmeinaktiveret FCS, 50U/ml penicillin / streptomycin, og 2 mg / ml G418 ( . PAA Laboratories) i gelatine overtrukne kolber Bemærk: Polyoma midten T-onkogen transfektion forårsager vækstfordel i EC&#39;er forhold til ikke-EC&#39;er, der fører til en homogen monolag af celler med endotel morfologi 4 til 6 uger i kultur. GPENeo ikke er kommercielt tilgængelige og kan fås som delt offentlig materiale (se originale publikationer 4,16). </li><li> At anvende det virusholdige medium for<html> immortalisering, dyrke GPENeo cellerne i G418-frit medium i 24 timer. </li><li> Fjern 10 ml af GPEneo supernatanten, og der tilsættes Polybrene (hexadimethrine bromid) (Sigma) til en slutkoncentration på 8 ug / ml og steriliseres gennem 0,45 um filter til fjernelse af cellulære fragmenter. </li><li> Fjern vækstmedium fra EF kulturer fremstillet i del 1 og tilsæt 2 ml GPEneo supernatant / Polybrene blandingen i brøndene. Gentag det næste dag med en frisk GPEneo supernatant / Polybrene blanding Note:. Polybrene anvendes til fremstilling af porer i cellevæggen at lette infektion med de virale partikler). </li><li> Fjern GPEneo supernatant / Polybrene blanding den følgende dag vaskes cellerne to gange med PBS og vedligeholde cellerne i vækstmediet ændrede det hver 3. dag. Ved konfluens, opdeles cellerne 1:2 på collagen IV-coatede plader. </li><li> Typisk bør stabile cerebrale endotelceller (cEND) cellelinier opnås 4-5 uger senere. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Dyrke The Brain mikrovaskulære endotelceller <ol><li> Tø cellerne fra cryoaliquot i vandbad og overføres i 15 ml Falcon-med 10 ml forvarmet medium. </li><li> Centrifugér suspensionen ved 250 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Fjern mediet, overføres pelleten i collagen IV overtrukne T 25 cm2 cellekultur kolbe med forvarmet vækstmedium (celledensitet til udpladning bør være mindst 1 x 10 4 celler / ml). </li><li> Skift medium den næste dag, og efter at cellerne nåede konfluens (normalt efter 5 dage) opdele cellerne. </li></ol> 4. Opdeling af cEND-celler (Bemærk: Opdeling bør kun ske en gang om ugen, Undgå Splitting Højere end 1:4). <ol><li> Fjern medium, vaske cellerne med PBS. </li><li> Tilsæt 3 ml varm trypsin-EDTA-opløsning (PAA Laboratories) (T 75 cm2 kolbe), inkuber ved 37 ° C og vente, indtil cellerne lag dispergeres (sædvanligvis inden for 5-15 min). </li><li> Tilsæt 5 ml of vækstmedium, pipetteres op og ned, og overføres til et nyt collagen IV-belagte kolbe. </li></ol> 5. Frysning af cEND-celler <ol><li> Opnåelse af cellesuspensionen som beskrevet i trin 4. </li><li> Centrifugér suspensionen ved 250 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Resuspender cellepelleten (opnået fra 1 T 75 cm2 kolbe) i 6 ml frysemedium (95% vækstmedium, 5% DMSO). </li><li> Opdel cellesuspensionen i fire 1,5 ml cryo-portioner Bemærk:. En cryo-aliquot kan podes på T 25 cm 2 kolbe. </li><li> Opbevar cryo-portioner under flydende nitrogen damptemperatur. </li></ol> cEND vækstmedium: 450 ml DMEM, 10% FCS, 10 ml L-glutamin, 2% MEM-Kit, 2% NEAA, 10 ml natrium-pyruvat, 50 U / ml penicillin / streptomycin 6. Repræsentative resultater De cEND og cerebEND celler var karakteriseret ved immunostainings af endothelial ennd BBB markører såvel som ved måling af transendothelial elektrisk modstand (TEER) og permeabilitet. The cEND og cerebEND havde en morfologi svarende til primære kulturer af hjerne-EC&#39;er med monolag af tætpakkede langstrakte celler, der udviste vækstinhibering ved konfluens. Cellerne udtrykte godt påviselige niveauer af claudin-5, occludin og VE-cadherin-proteiner, som blev lokaliseret ved celle-celle-kryds, som vist ved immunfluorescens (fig. 3) 4,5. Dyrkning cEND celler i serum-reduceret medium ført til en stigning i TEER (fra 150 Qcm 2 i nærvær af 10% serum til 500 Qcm 2 i nærvær af 2% serum), der blev forstærket ved tilsætning af hydrocortison (800 Wcm 2) eller insulin (1.000 Wcm 2) 4. Monolag af cEND dyrket i serum-reduceret medium i 21 dage havde TEER på 900 Qcm 2 (figur 4). TEER blev målt under anvendelse af en samlingindeholdende strøm-passing og spændings-måling elektroder (Verden Precision Instruments). Til sammenligning er den primære mikrovaskulære hjernen EC&#39;er blevet rapporteret at have TEER værdier på 200 til 600 Qcm 2 og et kommercielt tilgængeligt musecellelinie bEnd.3 havde TEER værdier på 100 til 140 Qcm 2 (for nylig oversigt se Abbot 2005 og Toth et al., 2011 17,18). Desuden blev passagen af ​​makromolekyler, såsom ikke-ladet FITC-dextraner med molekylmasser 4, 10, 70 og 500 kDa, eller fluorescein (300 Da) over monolag af cEND i 2% FCS differentiering medium over 4 timer faldt sammenlignet med kontrolceller opretholdt i vækstmedium indeholdende 10% FCS: paracellulær flux blev reduceret til 30% af kontrolceller for fluorescein, til 26% for FITC-dextraner 10 og 70 kDa, og flusmiddel blev reduceret til 4,5% af kontrolceller for FITC -dextrtan 500 kDa. Svarende til TEER-værdier, permeabiliteten var på det laveste niveau i celler dyrket i nærvær af glucocorticoids (GC) 4. I yderligere undersøgelser, identificerede vi glucocorticoid målgener, occludin, claudin-5 og VE-cadherin i hjernen vaskulært endotel 4,7,9. GC behandling førte til en stigning i ekspressionen af ​​disse proteiner, og til omlejring af VE-cadherin til cytoskelettet. Den direkte GC-medieret regulering af tight junction proteiner occludin og claudin-5 vises gennem GC respons elementer i deres promotorregioner 4,7,19. Derudover claudin-5 blev identificeret som en ny østrogen mål i vaskulært endotel 10. Endotheliale dysfunktion ligger til grund for mange forskellige sygdomme. Vi dyrket den cEND under ilt / glucosemangel (OGD) betingelser. OGD førte til forstyrrelse af BBB-funktion, som kunne rekonstitueres efter kombineret behandling med GC og proteasominhibitor bortezomib 12. OGD betingelser ført til en kraftig stigning i glucoseoptagelse og i ekspressionen af ​​glucose transporbreve i cerebEND, hvilket kan være svækket ved tilsætning af MK801, en ​​ikke-kompetitiv inhibitor af NMDA-receptoren 13. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> Figur 1. Morfologi af hjernen mikrovaskulære endotelceller (cEND) en uge efter isolering. Lysmikroskopi billeder blev taget under 6x (A) og 15x (B) forstørrelse. De ø-dannede kolonier af endotelceller er synlige. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> Figur 2. Morfologi af hjernens mikrovaskulære endotelceller (cEND) en måned efter isolering og immortalisering. Lysmikroskopi billeder blev taget under 15x forstørrelse. En sammenflydende, homogen endothelcelle-monolag kan observeres. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> Figur 3. Udødeliggjort hjerne microvascular endotelceller udtrykker claudin-5, occludin og VE-cadherin. CEND celler blev dyrket på collagen IV-overtrukne dækglas og farvet med antistoffer mod claudin-5 (A), occludin (B) og VE-cadherin (C). Billederne blev taget med et Zeiss Axioscop2 mikroskop under 40 gange forstørrelse. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> Figur 4. Måling af transendothelial elektrisk modstand (TEER) af cEND monolag. CEND blev dyrket på collagen IV-coatede transwell-filtre (porestørrelse 0,4 um). Efter at have nået konfluens blev cellerne opretholdt i medium indeholdende 2% FCS. TEER blev målt efter 7, 14 og 21 dage ved hjælp af en samling, der indeholder strøm-passing og spændings-måling elektroder.

<ol>
	<li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier.">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113 (2011).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier.">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937 (2008).</li><li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872 (2005).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).</li><li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli.">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37 (2006).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific.">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).</li><li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter.">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19 (2009).</li><li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND.">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937 (2007).</li><li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells.">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139 (2008).</li><li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium.">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298 (2010).</li><li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis.">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293 (2010).</li><li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome.">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081 (2011).</li><li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen/glucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells.">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44 (2012).</li><li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279 (2005).</li><li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells.">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203 (2002).</li><li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+function+of+the+blood-brain+barrier:+incomplete+presentation+of+protein+(auto-)antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro.">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757 (1990).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CNS+barriers:+evolution,+differentiation,+and+modulation.">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5 (2005).</li><li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery.">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107 (2011).</li><li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element.">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39 (2008).</li><li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses.">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125 (1994).</li><li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases.">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100 (1994).</li><li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation.">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327 (2001).</li><li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521 (1990).</li><li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells.">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101 (1994).</li><li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435 (1990).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315 (2010).</li><li>Skaper, S. D., Conn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neurosciences. 2, 1303 (1990).</li><li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin,+an+endothelial+anticoagulant+protein,+is+absent+from+the+human+brain.">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362 (1986).</li><li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis.">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540 (2003).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Den beskrevne procedure kan anvendes til isolering af mikrovaskulære ECS fra forskellige musestammer og fra forskellige knock-out musestammer at undersøge de specifikke ændringer i vaskulært endotel-funktionen. Som en fremgangsmåde til immortalisering anvendte vi transformation med oncoproteinet af murin polyomavirus, Polyoma midterste T-antigen. Det omdanner hurtigt umodne endotelceller in vivo og in vitro 20,21,22. Andre fremgangsmåder til immortalisering af EC&#39;er beskrevet i litteraturen indbefatter for eksempel immortalisering med SV40 stort T-antigen fra Simian vakuolerende Virus 40 23, adenovirus genprodukt E1A 24 eller overekspression af den katalytiske underenhed af human telomerase 3. The immortalisering med PyMT er specifikt for den murine umodne EC&#39;er, der tillader opnåelse af en homogen EF kultur fra neonatale mus på kort tid. Immortalisering ændrer egenskaberne af celler og the resultater opnået med immortaliserede cellelinjer bør sammenlignes med enten primære celler eller eksperimenter in vivo med mus. PyMT udødeliggjort EF er blevet beskrevet at udtrykke høje niveauer af fibrinolytisk aktivitet som følge af forøget produktion af urokinase-plasminogenaktivator og nedsat produktion af plasminogenaktivatorinhibitorer 25. Direkte sammenligning af PyMT udødeliggjort bEND5 cellelinie med primær EC&#39;er afslørede, at både in vitro BBB-modeller er velegnede til T-celle-adhæsion studier 26. De cellelinjer etableret ifølge den beskrevne fremgangsmåde kan anvendes ved lav passage for at bibeholde barriereegenskaber ved høj ekspression af BBB og EF forbindelsesepitoper proteiner, som celler mister disse egenskaber under ældning. Således efter tab af barriereegenskaber, skal fremstillingen af ​​en ny cellelinie overvejes. Cell udpladningsdensitet bør være høj for EC&#39;er, da dette er kritisk for celleproliferation. Dette skal ses under isoleringsproceduren samt vedligeholdelse af den udødeliggjorte ECS. Hver ny cellelinie bør testes for dens barriereegenskaber og for mulig forurening med andre celletyper. EF monolag kan farvet med anti-galactocerebrosid, anti-glia-fibrillært surt protein og anti-glat muskulatur antigen som primære antistoffer for at udelukke kontaminering med oligodendrocytter, astrocytter og pericytter 4,27. At udelukke kontaminering med meningal vaskulatur, kan ekspressionen af thrombomodulin testes, som udtrykkes i alle kar med undtagelse af hjernen 28. Interessant nok immortaliserede mikrovaskulære endotelceller cellelinier isoleret fra forskellige hjerneområder forskellige i deres barriereegenskaber og modtagelighed for proinflammatoriske stimuli. Som et eksempel kan de cerebrale cEND og cerebellar cerebEND cellelinier nævnes 4,5. CerebEND viste, i sammenligningat cEND, lavere ekspressionsniveauer af større tight junction komponenter claudin-1 og occludin. Men niveauet af claudin-3 og -12 var højere i cerebEND. Barrierefunktionen af cerebEND celler lidt mere under en behandling med inflammatorisk mediator, TNFa end barriereegenskaberne af cEND celler gjorde 5. Højere cerebellar sårbarhed over for inflammatoriske stimuli, kan observeres in vivo i patienter med dissemineret sklerose og i dyremodel eksperimentel autoimmun encephalomyelitis 29. Disse interessante resultater viser nødvendigheden af at generere og karakterisering af individuelle in vitro modeller for de forskellige hjerneregioner, for at forbedre den fremtidige lægemiddelmålretning ind i hjernen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Renhed&gt; 98% </td></tr><tr><td> collagen IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5533 </td><td> 50 ug / ml i 50 mM eddikesyre </td></tr><tr><td> Collagenase / dispase </td><td> Roche </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Føtalt kalveserum (FCS) </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15110-1333 </td><td> slutkoncentration 10%, varmeinaktiveret (30 minutter ved 56 ° C) </td></tr&gt; <tr><td> L-glutamin </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> Opbevaring: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> Opbevaring: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Na-pyruvat </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> Neomycin (G418) </td><td> PAA Laboratories </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> Ikke essentielle aminosyrer (NEA) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> Opbevaring ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilin / Streptomycin </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> Opbevaring: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Phosphatbufret saltvand (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybren (hexadimethrine bromid) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 107.689 </td><td> 0,8 mg / ml i PBS, opbevaring ved -20 ° C </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0,05%, 0,02% EDTA i PBS </td></tr></tbody></table>

generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model

Epitel-og endotelceller (EF) bygger paracellulær barrierer, som beskytter væv fra det eksterne og interne miljø. Blod-hjerne-barrieren (BBB), der består af EF, astrocyt endelige fødder, pericytter og basalmembranen er ansvarlig for beskyttelse og homeostase af hjernen parenkym. In vitro BBB modeller er fælles værktøjer til at studere struktur og funktion af BBB på celleniveau. Et betydeligt antal af forskellige in vitro-BBB-modeller er blevet oprettet til forskning i forskellige laboratorier til dato. Normalt er cellerne opnået fra kvæg, svin, rotte eller mus hjernevæv (beskrevet nærmere i gennemgangen af Wilhelm et al. 1). Menneskelige vævsprøver er kun tilgængelige i et begrænset antal laboratorier eller virksomheder 2,3. Mens primære cellepræparater er tidskrævende og EF kulturer kan variere fra parti til parti, etablering af udødeliggjorte EF lines er i fokus for videnskabelig interesse. Her præsenteres en metode til oprettelse af en udødeliggjort hjerne mikrovaskulære EF linje fra neonatal musehjerne. Vi beskriver den procedure trin-for-trin notering på reagenser og løsninger anvendes. Fremgangsmåden indført ved vores laboratorium tillader isolering af en homogen immortaliseret endothelial cellelinie inden for fire til fem uger. Hjernen mikrovaskulære endotelceller cellelinier betegnet cEND 4 (fra cerebral cortex) og cerebEND 5 (fra cerebellar cortex), blev isoleret ifølge denne fremgangsmåde i Förster laboratoriet og er blevet effektivt anvendt til forklaring af forskellige fysiologiske og patologiske processer i BBB. Ved hjælp cEND og cerebEND vi har vist, at disse celler responderer på glucocorticoid-4,6-9 og østrogen-treatment 10 samt pro-inflammatoriske mediatorer, såsom TNFalfa 5,8. Desuden har vi undersøgt patologien af ​​multipel sclerosis 11 og hypoxi 12,13 på EF-niveau. Den cEND og cerebEND linjer kan betragtes som et godt redskab til at studere struktur og funktion af BBB, cellulære responser af ECS på forskellige stimuli eller et samspil mellem EF med lymfocytter eller kræftceller.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model at JoVE.com

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Denne metode beskriver hvordan du isolerer og udødeliggøre mikrovaskulære endotelceller fra musehjerne. Vi beskriver en trin-for-trin-protokollen begyndende fra homogenisering af hjernevævet, fordøjelse trin, podning og immortalisering af cellerne. Normalt vil det tage omkring fem uger for at opnå en homogen, immortaliseret mikrovaskulære endotel-cellelinie.

Generering af en immortaliseret murin Brain mikrovaskulær endotel cellelinie som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolering af Primary Murine Brain mikrovaskulære endotelceller

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Sammenknytning 3D Engineered neuronkulturer til Micro-elektrode Arrays: Et innovativt<em&gt; In vitro</em&gt; Forsøgsmodel

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

En In Vivo blod - hjerne barrieren permeabilitet Assay i mus ved hjælp af Fluorescently mærket røbestoffer

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

En In Vivo evaluering af blod - hjerne barrieren forstyrrelser i en rotte Model af iskæmisk slagtilfælde

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

En præklinisk model til vurdering af hjerne bedring efter akut slagtilfælde hos rotter

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Fokuseret ultralydinduceret blod-hjerne-barriereåbning til målretning af hjernestrukturer og evaluering af kemogenetisk neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Hele nyfødte cochlear eksplanter som en in vitro model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

Registrering af barrierefunktionel integritet på bEnd.3 Vaskulære endotelceller via transendotelial elektrisk modstandsdetektion

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Rekonstruktion af blod-hjerne-barrieren in vitro til modellering og terapeutisk målretning af neurologisk sygdom

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...