Name: generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model
Uploaded: 2012-08-29T13:00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה DFG תחת מספר מענק FO 315/4-1 וDFG SFB 688.

1. בידוד של המוח Microvessels <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל אחד להשתמש בהכנה 09:55 עכברי ילוד מהמין (3-5 ימים ישנים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את עכבר על פי המלצות מקומיות IACUC / וטרינר, להסיר את המוח באופן מיידי, והעברה לצלחת הפטר שמכילה את הפתרון הבא: 15 מ&quot;מ (Hepes pH 7.4), 153 המ&quot;מ NaCl, KCl 5.6 מ&quot;מ, 2.3 המ&quot;מ CaCl 2 x 2H 2 הו, 2.6 המ&quot;מ MgCl 2 x 6H 2 O,% 1 (w / v) BSA (להלן כלמאגר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלא אם צוין אחרת, כל נהלי הבידוד צריכים להתבצע בטמפרטורת חדר (RT) (22-24 ° C) מתחת למכסת מנוע הזרימה למינרית. חותך את המוח (מוח בלי מוח קטן וגזע מוח), לאחר הסרת קרומי המוח ושברי נימים, במאגר באמצעות אזמל סטרילי. פיפטה הרקמה שברים למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 10 מ&quot;ל עד שלא יופיעו גושים. להעביר את ההשעיה לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל וצנטריפוגה XG ב 250 למשך 5 דקות בRT. </li></ol> הערה: קרום מוח יכול להיות מזוהה כקרומים דקים ושקופים על פני השטח של רקמת המוח. ניתן להסיר אותם בזהירות עם מלקחיים סטרילית. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס את הגלולה במאגר המ&quot;ל 4.5 עם 1.5 מ&quot;ל של 0.75% (w / v) collagenase / dispase (רוש) ודגירה במשך 45 דקות על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים (לעתים רועד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין את לוחות 12-גם על ידי ציפוי ארבע בארות בקולגן IV (0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​הומס בחומצה אצטית 50 מ&quot;מימ). אפשר לדבוק לשעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את מערכת העיכול על ידי תוספת של 15 מ&quot;ל החיץ א resuspend קר כקרח הגלולה ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG עבור 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר המיאלין, יוסיף 10 25% מ&quot;ל (w / v) BSA (Sigma, טוהר&gt; 98%) וצנטריפוגה XG ב 1000 עבור 20 דקות ב 4 ° C. BSA 25% צריך להיות מומס ב1x PBS (Paa מעבדות) ומסונן דרך f 0.2 מיקרומטרilter). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשליך בזהירות את supernatant, לפזר את הגלולה במאגר 10 מ&quot;ל ולהעביר לצינור פלקון חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG למשך 5 דקות בRT. גלולת כתוצאה מכילה את תאי האנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמי צלחת קולגן IV-12-המצופית היטב עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלול ב 4 מ&quot;ל של מדיום גידול (DMEM המכיל 10% FCS, 50U/ml פניצילין / סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין) וצלחת השעית התא לשתי בארות, 2 מ&quot;ל לכל באר. הוסף puromycin לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ודגירה במשך 45 דקות על 37 מעלות צלזיוס בתא תרבות חממה. שלב זה מאפשר הסרת תאים במהירות דבקות הערה:. Puromycin מתווסף ל24 שעות. רק המוח ECs יכול לעכל אותו, לסוגי תאים אחרים puromycin הוא רעיל 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה בינוני 2 מ&quot;ל מכילים תאים שאינם דבקים-מצעד 1.14 לשתי בארות טריות (בארות אלה מכילות שבריר EC). מלא את הבארות עם תאים דבקו מבקעמ &#39;1.14 במדיום טרי מ&quot;ל 2 (בארות אלה מכילים סוגים אחרים של תאים פיברובלסטים, למשל, האסטרוציטים, וניתן לגדל במקביל ומשמשות להשוואות של המורפולוגיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי הבינוני ביום המחרת. </li></ol> 2. מנציח את תאי אנדותל כלי הדם במוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח GP + E-86 (ניאו GPENeo) 15 פיברובלסטים, מפרישי וירוס שכפול לקוי עם אונקוגן polyoma אמצע T במדיום DMEM FCS המכיל 10% חום מומת, 50U/ml פניצילין / סטרפטומיצין, ו2 מ&quot;ג / המ&quot;ל G418 ( . Paa מעבדות) בצלוחיות מצופות ג&#39;לטין הערה: transfection אונקוגן T אמצע Polyoma גורם יתרון צמיחה של מעל ECs הלא ECS-מובילה לmonolayer הומוגנית של תאי אנדותל עם מורפולוגיה 4 עד 6 שבועות של התרבות. GPENeo אינו זמין באופן מסחרי וניתן להשיג כחומר ציבורי משותף (עיין בפרסומים מקוריים 4,16). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתמש במדיום המכיל וירוס עבור<html> הנצחה, לטפח את תאי GPENeo במדיום G418-חינם עבור 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת 10 מ&quot;ל של GPEneo supernatant ולהוסיף Polybrene (hexadimethrine רומיד) (Sigma) לריכוז סופי של מיקרוגרם 8 / מ&quot;ל, לעקר דרך 0.45 מיקרומטר מסנן כדי להסיר את הברים הסלולריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום גידול מתרבויות EC הוכנו בחלק 1 ולהוסיף 2 מ&quot;ל של תערובת GPEneo supernatant / Polybrene לתוך הבארות. חזור על אותו למחרת באמצעות תערובת טריה GPEneo supernatant / Polybrene הערה:. Polybrene משמשת כדי להפוך את הנקבוביות בקיר התא כדי להקל את הזיהום בחלקיקים הנגיפיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את GPEneo תערובת supernatant / Polybrene למחרת, לשטוף את תאי פעמים עם PBS ולשמור את התאים במדיום הגידול המשתנים כל 3 ימים. לאחר המפגש, לפצל את התאים 01:02 על צלחות קולגן IV מצופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, (cEND) קווי אנדותל מוחיים יציבים סלולריים יש לקבל כעבור 4-5 שבועות. </li></ol>&quot;&gt; 3. טיפוח דואר תאי האנדותל כלי הדם במוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר את התאים מcryoaliquot באמבט מים והעברה ב15 מ&quot;ל-פלקון עם 10 בינוניים מראש התחמם מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG למשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני, להעביר את הכדור בבקבוק קולגן IV המצופה T 25 סנטימטרי 2 תא התרבות עם מדיום גידול מחומם מראש (צפיפות תאים לציפוי צריכה להיות לפחות 1x 10 4 תאים / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בינוני למחרת ולאחר שהתאים הגיעו למפגש (בדרך כלל לאחר 5 ימים) לפצל את התאים. </li></ol> 4. פיצול תאי cEND (הערה: פיצול צריך להיעשות רק פעם בשבוע, יש להימנע מפיצול גבוה יותר מאשר 1:4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני, לשטוף את התאים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של טריפסין-EDTA פתרון החם (Paa מעבדות) (75 סנטימטר 2 בקבוק T), דגירה על 37 מעלות צלזיוס ולחכות עד ששכבת תאים מפוזרת (בדרך כלל בתוך 5 עד 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 המ&quot;ל oמדיום גידול f, פיפטה מעלה ומטה, ומעביר לבקבוק קולגן IV מצופה חדש. </li></ol> 5. הקפאת cEND התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את השעית התא כמתואר בשלב 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG למשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא הגלול (המתקבל מ 2 סנטימטר בקבוק 1 T 75) במדיום הקפאת מ&quot;ל 6 (95% צמיחה בינונית, 5% DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלק את השעית התא לארבע 1.5 המ&quot;ל cryo-aliquots הערה:. Cryo-aliquot אחד יכול להיות seeded על 2 סנטימטר בקבוק T 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את-aliquots cryo תחת טמפרטורת אדי חנקן נוזלית. </li></ol> cEND מדיום גידול: 450 המ&quot;ל DMEM, 10% FCS, 10 מיליליטר L-גלוטמין, 2% MEM-קיט, 2% NEAA, פירובט 10 מיליליטר נתרן, 50 U / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין 6. נציג תוצאות תאי cEND וcerebEND התאפיינו immunostainings של אנדותלnd BBB סמנים כמו גם על ידי מדידות של התנגדות transendothelial החשמלית (TEER) וחדירות. CEND וcerebEND היה מורפולוגיה דומה לתרבויות העיקריות של המוח ECs, עם monolayers של תאים מוארכים צפופים שהוצגו עיכוב גדילה במפגש. התאים בטאו רמות גם לגילוי של claudin-5, occludin וחלבוני VE-cadherin שהיו נקודות בצומת תאי תאים, כפי שמוצגות על ידי immunofluorescence (3 איור) 4,5. תאי cEND culturing במדיום סרום מופחת הובילו לעלייה בTEER (מ 150 Ωcm 2 בנוכחות של 10% בסרום עד 500 Ωcm 2 בנוכחות של 2% סרום), שpotentiated על ידי התוספת של הידרוקורטיזון (800 Ωcm 2) או אינסולין (1000 Ωcm 2) 4. Monolayers של cEND תרבית במדיום סרום מופחת במשך 21 ימים היה TEER של 900 Ωcm 2 (איור 4). TEER נמדד באמצעות הרכבההמכילים אלקטרודות נוכחי גניבה ומתח מדידה (מכשירי Precision עולם). לשם השוואה, כלי דם המוח העיקרי ECs דווח לי ערכי TEER של 200-600 Ωcm 2 ושורת תאי עכבר זמינה מסחרי bEnd.3 היו ערכי TEER של 100-140 Ωcm 2 (לסקירה האחרונה לראות אבוט 2005 וטות et אל., 2011 17,18). בנוסף, המעבר של מקרומולקולות, כגון שאינם טעון FITC-dextrans של המונים מולקולריים 4, 10, 70 ו 500 KDA, או fluorescein (300 דא) על פני monolayer של cEND ב2% בינוניים בידול FCS מעל 4 שעות היה ירידה לעומת תאי ביקורת מנוהלים במדיום גידול המכיל 10% FCS: שטף paracellular הופחת ל 30% מתאי בקרה לfluorescein, עד 26% לFITC-dextrans 10 ו 70 kDa, ושטף הופחת ל -4.5% מתאי בקרה לFITC Dextrtan-500 kDa. בדומה לTEER ערכים, החדירות היו ברמה הנמוכה ביותר בתאים בתרבית בנוכחות gluc4 ocorticoids (GC). במחקרים נוספים, זיהו את גני מטרת glucocorticoid, occludin, claudin-5 וVE-cadherin בהאנדותל כלי דם במוח 4,7,9. טיפול GC הוביל לעלייה בביטוי של חלבונים אלו, והארגון מחדש של VE-cadherin לcytoskeleton. הרגולציה הישירה GC בתיווך של חלבונים ההדוקים הצומת occludin וclaudin-5 מופיעה דרך אלמנטי תגובה GC באזורי אמרגן 4,7,19. בנוסף, claudin-5 זוהו כמטרת אסטרוגן רומן ב10 האנדותל בכלי דם. בבסיס תפקוד האנדותל מחלות רבות ושונות. אנו תרבית cEND תחת חמצן / חסך (OGD) תנאי גלוקוז. OGD הוביל לשיבוש תפקוד BBB, שניתן לשחזר לאחר טיפול משולב עם GC והמעכב 12 לקייד הפרוטאזום. תנאי OGD הביאו לעלייה חזקה בספיגת הגלוקוז ובביטוי של transpor גלוקוזters בcerebEND, אשר יכול להיות מוחלש על ידי התוספת של MK801, מעכב הלא תחרותי של NMDA קולטן 13. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> איור 1. מורפולוגיה של תאי מוח כלי דם (אנדותל cEND) בשבוע אחד אחרי בידוד. תמונות מיקרוסקופ אור נלקחה תחת (ב) הגדלת 6x () ו15x. מושבות האי נוצרו-של תאי האנדותל גלויות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> איור 2. מורפולוגיה של תאי אנדותל כלי דם במוח (cEND) חודש לאחר בידוד והנצחה. תמונות מיקרוסקופ אור נלקח תחת גדלת 15x. Monolayer מחובר, הומוגנית אנדותל תא ניתן לצפות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> איור 3. microvascul המוח הונצחתאי האנדותל ar מפורש claudin-5, occludin וVE-cadherin. תאי CEND גדלו על coverslips קולגן IV המצופה ומוכתמים בנוגדנים נגד claudin-5 (א), occludin (B) וVE-cadherin (C). התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ Axioscop2 Zeiss מתחת לעדשות 40X. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> איור 4. מדידת ההתנגדות חשמלית transendothelial (TEER) של monolayer cEND. CEND גדלה על מסנני transwell IV מצופים קולגן (0.4 מיקרומטר גודל נקבובי). לאחר שהגיע למפגש, התאים נשמרו במדיום המכיל 2% FCS. TEER נמדד לאחר 7, 14 ו 21 ימים באמצעות הרכבה המכילה אלקטרודות נוכחי גניבה ומתח המדידה.

<ol>
	<li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier.">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113 (2011).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier.">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937 (2008).</li><li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872 (2005).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).</li><li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli.">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37 (2006).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific.">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).</li><li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter.">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19 (2009).</li><li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND.">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937 (2007).</li><li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells.">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139 (2008).</li><li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium.">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298 (2010).</li><li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis.">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293 (2010).</li><li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome.">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081 (2011).</li><li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen/glucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells.">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44 (2012).</li><li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279 (2005).</li><li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells.">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203 (2002).</li><li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+function+of+the+blood-brain+barrier:+incomplete+presentation+of+protein+(auto-)antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro.">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757 (1990).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CNS+barriers:+evolution,+differentiation,+and+modulation.">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5 (2005).</li><li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery.">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107 (2011).</li><li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element.">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39 (2008).</li><li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses.">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125 (1994).</li><li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases.">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100 (1994).</li><li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation.">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327 (2001).</li><li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521 (1990).</li><li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells.">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101 (1994).</li><li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435 (1990).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315 (2010).</li><li>Skaper, S. D., Conn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neurosciences. 2, 1303 (1990).</li><li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin,+an+endothelial+anticoagulant+protein,+is+absent+from+the+human+brain.">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362 (1986).</li><li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis.">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540 (2003).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ההליך המתואר יכול לשמש לבידוד של כלי הדם ECS מזנים שונים של עכברים, כמו גם מזנים שונים עקום החוצה עכברים כדי ללמוד את השינויים הספציפיים בתפקוד האנדותל בכלי דם. כדרך להנצחה הייתי שינוי עם oncoprotein של polyomavirus העכברי, אנטיגן T Polyoma האמצע. זה הופך את תאי האנדותל בשלה במהירות in vivo ו במבחנה 20,21,22. שיטות אחרות להנצחה של ECs תוארו בספרות כוללות למשל הנצחה עם האנטיגן SV40 גדול T של וירוס Vacuolating קופי 40 23, גן ​​מוצר אדנווירוס 24 E1A או ביטוי יתר של המקטע הקטליטית של telomerase האנושי 3. ההנצחה עם PymT היא ספציפית לECs הבוסר העכברי, המאפשר קבלת תרבות EC הומוגנית מעכברים ילודים בזמן קצר. הנצחה משנה את התכונות של התאים והתוצאות שהושגו עם דואר שורות תאים הנציחו יש להשוות גם עם תאים ראשוניים או בניסויי in vivo בעכברים. PymT EC הונצח תואר להביע רמות גבוהות של פעילות fibrinolytic הנובעות מייצור מוגבר של urokinase סוג plasminogen activator וירידה בייצור של plasminogen activator 25 מעכבים. השוואה ישירה של PymT הונצחה קו bEND5 תא עם ECS הראשונית עלה, כי הן במודלים חוץ גופיית BBB מתאימים גם ללימודי הידבקות תא T 26. שורות התאים הוקמו בהתאם לנוהל שתואר ניתן להשתמש במספר מעבר נמוך כדי לשמור על נכסי מכשול על ידי ביטוי גבוה של חלבוני junctional BBB ו-EC, כמו תאים מאבדים מאפיינים אלה במהלך ההזדקנות. לכן לאחר אובדן נכסי מכשול, ההכנה של שורת תאים חדשה צריכה להיחשב. צפיפות תאי ציפוי צריכה להיות גבוהה לECs, כמו זו היא קריטית לשגשוג תאים. זה יש לבחון במהלך הליך הבידוד, כמו גם תחזוקה של ECs הונצח. כל שורת תאים חדשה צריכה להיבדק על נכסי המכשול ולמזהמים אפשריים עם סוגי תאים אחרים. monolayers EC ניתן מוכתם בחומץ חלבון אנטי galactocerebroside, אנטי גליה fibrillary ואנטי חלק אנטיגן שרירים כמו נוגדנים ראשוניים שלא לכלול את הזיהום עם oligodendrocytes, האסטרוציטים וpericytes 4,27. כדי לשלול זיהום על ידי מערכת כלי דם meningal, הביטוי של thrombomodulin ניתן לבדוק, שבא לידי ביטוי בכל ערוצי כלי הדם, למעט המוח 28. מעניין, את הקווים הנציחו כלי דם אנדותל התאים שאזורי מוח שונים נבדלים בתכונות וגם ברגישות שלהם לגירויי המכשול פרו דלקתיים. כדוגמה, שורות תאי המוח והמוח קטן cEND cerebEND ניתן לציין 4,5. CerebEND הראה, בהשוואהלcEND, רמות ביטוי נמוכות יותר של רכיבי צומת ההדוקים העיקריים claudin-1 וoccludin. עם זאת, ברמות של claudin-3 ו -12 היו גבוהות יותר בcerebEND. תפקוד המחסום של תאי cerebEND סבל הרבה יותר תחת טיפול עם המתווך הדלקתי, TNFα ממאפייני המכשול של תאי cEND עשו 5. פגיעות מוח קטנות יותר לגירויים דלקתיים, ניתן להבחין בחי בחולי טרשת נפוצה ובניסיוני מודל החיה שלה אוטואימונית Encephalomyelitis 29. ממצאים מעניינים אלה עולים הצורך ביצירה ואפיון פרטני במודלים חוץ גופייה לאזורים שונים של מוח, על מנת לשפר את תרופת עתיד מיקוד לתוך המוח.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> שור אלבומין (BSA) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A7906 </td><td> טוהר&gt; 98% </td></tr><tr><td> קולגן IV </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C5533 </td><td> 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בחומצה אצטית 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Collagenase / Dispase </td><td> רוש </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> המדיום של Dulbecco העדכון של הנשר (DMEM) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> sulfoxide דימתיל (DMSO) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> עוברי עגל בסרום (FCS) </td><td> מעבדות Paa </td><td> A15110-1333 </td><td> ריכוז סופי של 10%, חום מומת (30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס) </td></tr&gt; <tr><td> L-גלוטמין </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> אחסון: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> אחסון: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Na-פירובט </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> נאומיצין (G418) </td><td> מעבדות Paa </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> חומצות האמין שאינם חיוניות (רח&quot;ל) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> אחסון ב 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilin / סטרפטומיצין </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> אחסון: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> נאגר מלוח פוספט (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene (hexadimethrine רומיד) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 107689 </td><td> 0.8 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב PBS, אחסון ב -20 ° C </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0.05%, 0.02% EDTA ב PBS </td></tr></tbody></table>

generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model

תאי אפיתל ואנדותל (EC) בונים מחסומי paracellular אשר להגן על הרקמות מהסביבה החיצונית והפנימית. מחסום דם המוח (BBB) ​​בהיקף של EC, בסוף הרגליים, pericytes astrocyte וקרום הבסיס הוא אחראי להגנה והאיזון של parenchyma המוח. במודלים חוץ גופיית BBB הם כלים משותפים ללימוד המבנה והתפקוד של BBB ברמה התאית. מספר לא מבוטל של דגמים שונים במבחנת BBB הוקם במשך מחקר במעבדות שונות עד היום. בדרך כלל, את התאים מתקבלים ממקור הבקר, חזיר, עכברוש רקמת מוח או עכבר (נדון בהרחבה בביקורת על ידי וילהלם et al. 1). דגימות רקמה אנושיות הן זמינות רק במספר מצומצם של מעבדות או חברות 2,3. בעוד הכנות ראשוניות של תא הן זמן רבים ותרבויות EC יכולות להיות שונות מיצווה כדי תצווה, ההקמה הונצחה EC ליןes הוא מוקד העניין מדעי. כאן, אנו מציגים שיטה לקביעת קו הונצח מוח כלי דם EC ממוח עכבר ילוד. אנו מתארים את רישום צעד אחר צעד הליך ריאגנטים ופתרונות בשימוש. השיטה שהוקמה על ידי המעבדה שלנו מאפשרת בידוד של קו הומוגני הונצח אנדותל תא בתוך ארבעה עד חמישה שבועות. שורות תאי אנדותל כלי הדם במוח המכונות cEND 4 (מקליפת מוח) וcerebEND 5 (מקליפת המוח הקטנה), היינו מבודדים על פי נוהל זה במעבדת פורסטר ויש יעילות בשימוש להסבר של תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים שונים בב&quot;ב. שימוש cEND וcerebEND אנו מראים כי תאים אלה מגיבים לglucocorticoid-4,6-9 ואסטרוגן טיפול 10, כמו גם למתווכים פרו infammatory, כגון TNFalpha 5,8. יתר על כן, יש לנו למדנו את הפתולוגיה של מרובה sc11 lerosis והיפוקסיה 12,13 ב EC ברמה. CEND וקווי cerebEND יכולים להיחשב ככלי טוב ללימוד המבנה והתפקוד של BBB תגובות, הסלולריות של ECs לגירויים או באינטראקציה שונים של EC עם ימפוציטים או תאים סרטניים.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model at JoVE.com

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

שיטה זו מתארת ​​כיצד לבודד ולהנציח תאי אנדותל כלי דם ממוח עכבר. אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד החל מהומוגניזציה של רקמת מוח, שלבי עיכול, זריעה והנצחה של התאים. בדרך כלל, זה לוקח בערך חמישה שבועות כדי להשיג קו אחיד, שהונצח כלי דם האנדותל תא.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

התממשקות תרבויות 3D הנדסה עצבית למערכי מיקרו-אלקטרודה: חדשני<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם ניסיוני

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

הערכה In Vivo של מחסום הדם - מוח שיבוש במודל של עכברים של שבץ איסכמי

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

מודל טרום קליני להעריך את ההתאוששות המוח לאחר שבץ חריף בחולדות

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

אולטרסאונד ממוקד המושרה פתיחת מחסום דם-מוח למיקוד מבנים במוח והערכת נוירומודולציה כימוגנטית

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

צמחי שבלול שלמים של ילודים כמודל במבחנה

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

רישום תקינות תפקודית של מחסום ב-bend.3 תאי אנדותל וסקולריים באמצעות זיהוי התנגדות חשמלית טרנסאנדותל

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...