Name: generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model
Uploaded: 2012-08-29T13:00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG henhold prosjekt nummer FO 315/4-1 og DFG SFB 688.

1. Isolering av Brain Microvessels <ol><li> For hvert preparat bruke fem minutter på ti nyfødte mus av begge kjønn (3-5 dager gammel). </li><li> Avlive en mus i henhold til lokale IACUC / veterinær anbefalingene, fjerne hjernen umiddelbart, og overfør til en petriskål inneholdende følgende løsning: 15 mM HEPES (pH 7,4), 153 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,3 mM CaCl-2 x 2H 2 O, 2,6 mM MgCl 2 x 6H 2 O, 1% (w / v) BSA (heretter referert til som buffer A). </li><li> Mindre annet er angitt, skal alle isolasjon prosedyrer utføres ved romtemperatur (RT) (22-24 ° C) under laminær strømning hette. Skjær hjernen (cerebrum uten lillehjernen og hjernestammen), etter fjerning av hjernehinnene og kapillære fragmenter, i buffer A ved hjelp av en steril skalpell. Pipetter vevet fragmenter opp og ned ved hjelp av en 10 ml pipette til ingen klumper vises. Overfør suspensjonen i en 50 ml Falcon rør og sentrifuger ved 250 xg i 5 minutter ved RT. </li></ol> Merk: hjernehinnene kan identifiseres som tynne, gjennomsiktige membraner ved overflaten av hjernevev. De kan fjernes forsiktig med steril pinsett. <ol start="4"><li> Kast supernatanten. </li><li> Oppløs pelleten i 4,5 ml buffer A med 1,5 ml 0,75% (w / v) kollagenase / dispase (Roche) og inkuber i 45 min ved 37 ° C i et vannbad (tidvis risting). </li><li> Mellomtiden forbereder 12-brønners plater ved å belegge fire brønner med kollagen IV (0,1 mg / ml oppløst i 50 mM eddiksyre). Tillat å overholde i 1 time. </li><li> Stopp fordøyelsen ved tilsetning av 15 ml is-kald buffer A. Resuspender pellet grundig. </li><li> Sentrifuger suspensjonen ved 250 xg i 10 min ved RT. </li><li> Kast supernatanten. </li><li> Å fjerne myelin, tilsett 10 ml 25% (w / v) BSA (Sigma, renhet&gt; 98%) og sentrifuger ved 1000 xg i 20 min ved 4 ° C. 25% BSA skal oppløses i 1x PBS (PAA Laboratories) og filtrert gjennom 0,2 um fIlter). </li><li> Nøye forkaste supernatant oppløse pelleten i 10 ml buffer A og overfør til et nytt Falcon rør. </li><li> Sentrifuger suspensjonen ved 250 xg i 5 minutter ved RT. Den resulterende pellet inneholder endotelceller. </li><li> Vask to ganger kollagen IV-belagt 12-brønn plate med PBS. </li><li> Resuspender pelleten i 4 ml dyrkningsmedium (DMEM inneholdende 10% FCS, 50U/ml penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin) og plate cellesuspensjonen i to brønner, 2 ml til hver brønn. Tilsett puromycin til en endelig konsentrasjon på 4 ug / ml, og inkuber i 45 min ved 37 ° C i en cellekultur inkubator. Dette trinnet kan fjerne raskt fulgte celler. Merk: puromycin er lagt for 24 timer. Bare hjerne egenkapitalbevis kan forbrenne den, for andre celletyper puromycin er giftig 14. </li><li> Overfør 2 ml medium som inneholder ikke-levd celler fra trinn 1,14 til to friske brønner (disse brønnene inneholder EC fraksjon). Fyll opp brønnene med overholdt celler fra step 1,14 med 2 ml friskt medium (disse brønnene inneholder andre celletyper, f.eks fibroblaster astrocytes og kan dyrkes i parallelt og brukes for sammenligninger av morfologi). </li><li> Bytter mediet den påfølgende dagen. </li></ol> 2. Immortalizing hjernen mikrovaskulær endotelceller <ol><li> Dyrke GP + E-86 Neo (GPENeo) 15 fibroblaster secreting en replikering-mangelfull virus med polyoma midtre T onkogenet i DMEM medium inneholdende 10% varme-inaktivert FCS, 50U/ml penicillin / streptomycin, og 2 mg / ml G418 ( . PAA Laboratories) i gelatin belagt kolber Obs polyoma midtre T onkogen transfeksjon forårsaker vekst fordel egenkapitalbevis over ikke-ECS fører til en homogen monolag av celler med endotelisk morfologi 4-6 uker av kultur. GPENeo er ikke kommersielt tilgjengelig og kan fås som delte offentlige materiale (se originale publikasjoner 4,16). </li><li> Å bruke viruset-holdige medium for<html> immortalization, dyrke GPENeo celler i G418-fri medium i 24 timer. </li><li> Fjern 10 ml av GPEneo supernatant og legge polybren (hexadimethrine bromid) (Sigma) til en endelig konsentrasjon på 8 ug / ml, sterilisere gjennom 0,45 um filter for å fjerne de cellulære fragmenter. </li><li> Fjern vekstmediet fra EF kulturer utarbeidet i del 1 og tilsett 2 ml GPEneo supernatant / polybren blandingen inn i brønnene. Gjenta den neste dag ved hjelp av en frisk GPEneo supernatant / polybren blanding Merk:. Polybren brukes til å gjøre porene i celleveggen til rette infeksjonen med de virale partikler). </li><li> Fjerne GPEneo supernatant / polybren blanding neste dag, vaske cellene to ganger med PBS og vedlikeholde cellene i vekstmediet skiftende det hver 3. dag. Ved samløpet, dele cellene 01:02 på kollagen IV-belagte plater. </li><li> Vanligvis bør stabile cerebrale endotelceller (cend) cellelinjer oppnås 4-5 uker senere. </li></ol>e &quot;&gt; 3. dyrke Brain mikrovaskulær endotelceller <ol><li> Tine cellene fra cryoaliquot i vannbad og overføring i 15 ml-Falcon med 10 ml forvarmet medium. </li><li> Sentrifuger suspensjonen ved 250 xg i 5 minutter ved RT. </li><li> Fjern medium, overføre pelleten i kollagen IV belagt T 25 cm 2 cellekultur kolbe med forvarmede dyrkningsmedium (celletetthet for plating bør være minst 1x 10 4 celler / ml). </li><li> Endre medium neste dag og etter cellene nådde konfluens (vanligvis etter 5 dager) dele cellene. </li></ol> 4. Splitting av cend-celler (Merk: Splitting bør gjøres bare en gang i uken, unngå å splitte Høyere enn 1:4). <ol><li> Fjern medium, vask cellene med PBS. </li><li> Tilsett 3 ml varm trypsin-EDTA-oppløsning (PAA Laboratories) (T 75 cm 2 kolbe), inkuber ved 37 ° C og vente til celler laget dispergeres (vanligvis innen 5 til 15 min). </li><li> Tilsett 5 ml of vekst medium, pipetter opp og ned, og overføring til en ny kollagen IV-belagt kolbe. </li></ol> 5. Frysing av cend-celler <ol><li> Skaffe cellesuspensjonen som beskrevet i trinn 4 </li><li> Sentrifuger suspensjonen ved 250 xg i 5 minutter ved RT. </li><li> Resuspender cellepelleten (oppnådd fra en T 75 cm 2 kolbe) i 6 ml iskaldt medium (95% vekst medium, 5% DMSO). </li><li> Dele cellesuspensjonen i fire 1,5 ml kryo-aliquoter. Merk: Én Cryo-alikvot kan utsådd på T 25 cm 2 kolbe. </li><li> Oppbevar Cryo-alikvoter under flytende nitrogen damp temperatur. </li></ol> cend dyrkningsmedium: 450 ml DMEM, 10% FCS, 10 ml L-glutamin, 2% MEM-Kit, 2% NEAA, 10 ml natrium pyruvat, 50 U / ml penicillin / streptomycin 6. Representant Resultater De cend og cerebEND celler ble preget av immunostainings av endothelial ennd BBB markører så vel som ved måling av transendothelial elektrisk motstand (teer) og permeabilitet. Den cend og cerebEND hadde en morfologi som ligner på primære kulturer av hjernen egenkapitalbevis, med monolayers med tettpakkede langstrakte celler som viste veksthemming hos samløpet. Cellene uttrykt godt påvisbare nivåer av claudin-5, occludin og VE-cadherin proteiner som ble lokalisert ved celle-celle kryss, som vist ved immunfluorescens (Figur 3) 4,5. Dyrking cend celler i serum-redusert medium førte til en økning i teer (fra 150 2 Ωcm i nærvær av 10% serum til 500 Ωcm 2 i nærvær av 2% serum), som ble potensieres ved tilsetning av hydrokortison (800 Ωcm 2) eller insulin (1000 Ωcm 2) 4. Monolag av cend dyrket i serum-redusert medium i 21 dager hadde teer av 900 Ωcm 2 (figur 4). Teer ble målt ved hjelp av en sammenstillinginneholder strøm-pasninger og spenning-måleelektrodene (World Precision Instruments). Til sammenligning har den primære mikrovaskulær hjernen egenkapitalbevis blitt rapportert å ha Teer verdier 200-600 Ωcm 2 og en kommersielt tilgjengelig mus cellelinje bEnd.3 hadde Teer verdier 100-140 Ωcm 2 (for siste gjennomgang se Abbot 2005 og Toth et al., 2011 17,18). I tillegg ble passasjen av makromolekyler, slik som ikke-ladet FITC-dekstraner av molekylære masser 4, 10, 70 og 500 kDa, eller fluorescein (300 Da) over monolaget av cend i 2% FCS differensiering mediet over 4 hr redusert sammenlignet med kontrollceller vedlikeholdt i dyrkningsmedium inneholdende 10% FCS: paracellular fluks ble redusert til 30% av kontroll-celler for fluorescein, til 26% for FITC-dekstraner 10 og 70 kDa, og fluks ble redusert til 4,5% av kontroll celler for FITC -dextrtan 500 kDa. Ligner teer verdier, var permeabiliteten på laveste nivå i celler dyrket i nærvær av Glucocorticoids (GC) 4. I videre studier, identifiserte vi de glukokortikoid målgener, occludin, claudin-5 og VE-cadherin i hjernen vaskulært endotel 4,7,9. GC-behandling førte til en økning i ekspresjon av disse proteinene og til omordning av VE-cadherin til cytoskjelettet. Den direkte GC-mediert regulering av stram krysset proteiner occludin og claudin-5 vises gjennom GC respons elementer i sine promoter regioner 4,7,19. Tillegg, claudin-5 ble identifisert som en roman østrogen mål i vaskulært endotel 10. Endotelial dysfunksjon ligger til grunn mange forskjellige sykdommer. Vi dyrket den cend under oksygenfattige / glukose deprivasjon (OGD) forhold. OGD førte til avbrudd av BBB-funksjonen, som kunne rekonstitueres etter kombinert behandling med GC og proteasominhibitor bortezomib 12. OGD forhold førte til en sterk økning i glukoseopptak og i uttrykket av glukose transregistre i cerebEND, som kan dempes ved tilsetning av mk801, en ​​ikke-kompetitiv inhibitor av NMDA-reseptoren 13. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> Figur 1. Morfologi av hjernen mikrovaskulære endotelceller (cend) en uke etter isolering. Lysmikroskopi bilder ble tatt under 6x (A) og 15x (B) forstørrelse. Øya-formet kolonier av endotelceller er synlige. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> Figur 2. Morfologi av hjernen mikrovaskulære endotelceller (cend) én måned etter isolasjon og immortalization. Lysmikroskopi bildene ble tatt under 15x forstørrelse. En confluent, homogen endotelcelle monolayer kan observeres. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> Figur 3. Udødeliggjort hjernen microvascular endotelceller express claudin-5, occludin og VE-cadherin. cend celler ble dyrket på kollagen IV-belagte dekkglass og farget med antistoffer mot claudin-5 (A), occludin (B) og VE-cadherin (C). Bildene ble tatt med et Zeiss Axioscop2 mikroskop under 40x forstørrelse. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> Figur 4. Måling av transendothelial elektrisk motstand (Teer) av cend monolayer. Cend ble dyrket på kollagen IV-belagte Transwell filtre (porestørrelse 0,4 mikrometer). Etter å ha nådd konfluens, ble cellene opprettholdt i medium inneholdende 2% FCS. Teer ble målt etter 7, 14 og 21 dager ved hjelp av en forsamling som inneholder strøm-pasninger og spenning-måling elektroder.

<ol>
	<li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier.">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113 (2011).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier.">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937 (2008).</li><li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872 (2005).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).</li><li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli.">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37 (2006).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific.">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).</li><li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter.">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19 (2009).</li><li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND.">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937 (2007).</li><li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells.">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139 (2008).</li><li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium.">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298 (2010).</li><li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis.">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293 (2010).</li><li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome.">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081 (2011).</li><li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen/glucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells.">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44 (2012).</li><li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279 (2005).</li><li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells.">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203 (2002).</li><li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+function+of+the+blood-brain+barrier:+incomplete+presentation+of+protein+(auto-)antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro.">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757 (1990).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CNS+barriers:+evolution,+differentiation,+and+modulation.">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5 (2005).</li><li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery.">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107 (2011).</li><li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element.">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39 (2008).</li><li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses.">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125 (1994).</li><li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases.">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100 (1994).</li><li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation.">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327 (2001).</li><li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521 (1990).</li><li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells.">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101 (1994).</li><li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435 (1990).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315 (2010).</li><li>Skaper, S. D., Conn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neurosciences. 2, 1303 (1990).</li><li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin,+an+endothelial+anticoagulant+protein,+is+absent+from+the+human+brain.">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362 (1986).</li><li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis.">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540 (2003).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Den beskrevne prosedyre kan benyttes for isolering av mikrovaskulær ECS fra forskjellige musestammer samt fra forskjellige knock-out muselinjer å studere de bestemte endringene i vaskulært endotel funksjon. Som en fremgangsmåte for immortalization brukte vi transformasjon med oncoproteinet av murin polyomavirus, polyoma midtre T antigen. Det forvandler raskt umodne endotelceller in vivo og in vitro 20,21,22. Andre metoder for immortalization egenkapitalbevis beskrevet i litteraturen omfatter for eksempel immortalization med SV40 stort T antigen av Simian Vacuolating Virus 40 23, adenovirus genprodukt E1A 24 eller overekspresjon av den katalytiske subenhet av human telomerase 3. Den immortalization med PymT er spesifikk for den murine umodne ECS, som tillater å oppnå en homogen EC kultur fra neonatale mus i en kort tid. Immortalization endrer egenskapene av cellene og the resultater oppnådd med udødeliggjort cellelinjer bør sammenliknes enten med primære celler eller med eksperimenter in vivo med mus. PymT udødeliggjort EC har blitt beskrevet for å uttrykke høye nivåer av fibrinolytisk aktivitet som følge av økt produksjon av urokinase-attraksjon plasminogenaktivator og redusert produksjon av plasminogenaktivator-inhibitorer 25. Direkte sammenligning av PymT udødeliggjort bEND5 cellelinje med primær ECS avdekket at både in vitro BBB modeller er godt egnet for T-celle adhesjon studier 26. Cellelinjene etablert i henhold til den beskrevne fremgangsmåten kan brukes ved lav passasje nummer å opprettholde barriereegenskaper etter høy ekspresjon av BBB og EC junctional proteiner, som celler mister disse egenskaper under aldring. Dermed etter tap av barriereegenskaper, bør fremstillingen av en ny celle linje betraktes. Cell plating tetthet bør være høy for egenkapitalbevis, da dette er avgjørende for celleproliferasjon. Dette må tas hensyn til ved isolasjon prosedyren samt vedlikehold av foreviget ECS. Hver ny cellelinje bør testes for sine barriere egenskaper og for mulige forurensninger med andre celletyper. EC monolayers kan være farget med anti-galactocerebroside, anti-glial fibrillary syrlig protein og anti-glatt muskulatur antigen som primære antistoffer å utelukke forurensning med oligodendrocytes, astrocytes og pericytes 4,27. Å utelukke forurensning av meningal vaskulatur, kan uttrykket av trombomodulin testes, som uttrykkes i alle vaskulære senger med unntak av hjernen 28. Interessant, udødeliggjort mikrovaskulære endotelcelle linjer isolert fra ulike områder av hjernen varierer i sine barriere egenskaper og mottakelighet for pro-inflammatoriske stimuli. Som et eksempel, kan de cerebrale cend og lillehjernen cerebEND cellelinjer nevnes 4,5. CerebEND viste i sammenligningå cend, lavere uttrykk nivåer av store stramme veikryss komponenter claudin-1 og occludin. Imidlertid, var nivåene av claudin-3 og -12 høyere i cerebEND. Den barrierefunksjonen cerebEND celler led mye mer under en behandling med den inflammatoriske mediatoren TNFa enn barriereegenskaper cend celler gjorde 5. Høyere lillehjernen sårbarhet for inflammatoriske stimuli, kan observeres in vivo i pasienter med multippel sklerose og i sin dyremodell eksperimentell autoimmun encefalomyelitt 29. Disse interessante funn viser nødvendigheten av å generere og karakterisere individ in vitro modeller for forskjellige hjerneregioner, for å forbedre fremtidige stoffet målretting inn i hjernen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Renhet&gt; 98% </td></tr><tr><td> kollagen IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5533 </td><td> 50 ug / ml i 50 mM eddiksyre </td></tr><tr><td> Kollagenase / Dispase </td><td> Roche </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetylsulfoksyd (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Kalvefosterserum (FCS) </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15110-1333 </td><td> sluttkonsentrasjon 10%, varme-inaktivert (30 min ved 56 ° C) </td></tr&gt; <tr><td> L-glutamin </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> Lagring: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> Lagring: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Na-pyruvate </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> Neomycin (G418) </td><td> PAA Laboratories </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> Ikke essensielle aminosyrer (NEA) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> Lagring ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilin / Streptomycin </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> Lagring: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Fosfatbuffret saltvann (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybren (hexadimethrine bromide) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 107689 </td><td> 0,8 mg / ml i PBS, lagring ved -20 ° C </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0,05%, 0,02% EDTA i PBS </td></tr></tbody></table>

generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model

Epiteliale og endothelial celler (EC) bygger paracellular barrierer som beskytter vev fra det ytre og indre miljø. Blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​bestående av EC, astrocyte end-føtter, pericytes og basalmembranen er ansvarlig for beskyttelse og homeostase av hjernen parenchyma. In vitro BBB modeller er vanlige verktøy for å studere strukturen og funksjonen til BBB på cellenivå. Et betydelig antall av forskjellige in vitro BBB modeller har blitt etablert for forskning i ulike laboratorier til dags dato. Vanligvis, blir cellene oppnådd fra storfe, svin, rotte eller mus hjernevev (diskutert i detalj i gjennomgangen av Wilhelm et al. 1). Menneskelige vevsprøver er bare tilgjengelige i et begrenset antall laboratorier eller bedrifter 2,3. Mens primære celle forberedelsene er tidkrevende og EF kulturer kan variere fra parti til parti, etablering av foreviget EC lines er fokus for vitenskapelig interesse. Her presenterer vi en metode for å etablere en udødeliggjort hjernen mikrovaskulær EC linje fra neonatal mus hjernen. Vi beskriver fremgangsmåten trinn-for-trinn notering reagenser og løsninger som brukes. Metoden etablert av vårt laboratorium tillater isolering av en homogen udødeliggjort endotelcelle linje innen fire til fem uker. Hjernen mikrovaskulære endotelcelle linjer betegnet cend 4 (fra cerebral cortex) og cerebEND 5 (fra lillehjernen cortex), ble isolert i henhold til denne prosedyren i Förster laboratorium og er blitt effektivt brukt for forklaring av forskjellige fysiologiske og patologiske prosesser ved BBB. Bruke cend og cerebEND vi har vist at disse cellene reagerer glukokortikoid-4,6-9 og østrogen-behandling 10 samt til pro-infammatory mediatorer, slik som TNFa 5,8. Videre har vi studert patologi av flere sclerosis 11 og hypoksi 12,13 på EC-nivå. Den cend og cerebEND linjer kan betraktes som et godt verktøy for å studere struktur og funksjon av BBB, cellulære responser egenkapitalbevis på forskjellige stimuli eller interaksjon i EF med lymfocytter eller kreftceller.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model at JoVE.com

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Denne metoden beskriver hvordan du isolerer og forevige mikrovaskulære endotelceller fra mus hjernen. Vi beskriver en steg-for-steg-protokollen fra homogenisering av hjernevev, fordøyelse trinn, seeding og immortalization av cellene. Vanligvis tar det omtrent fem uker for å oppnå en homogen, udødeliggjort mikrovaskulær endotelisk cellelinje.

Generering av en udødeliggjort Murine Brain Mikrovaskulær endotelcelle Line som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolering av Primary murine Brain mikrovaskulære Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Grensesnitt 3D Engineered Nevronale kulturer til Micro-elektrode Arrays Et nyskapende<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

I Vivo blod - hjerne barrieren permeabilitet analysen mus med Fluorescently merket Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Bedømme i Vivo blod - hjerne barrieren avbrudd i en rotte modell av iskemiske hjerneslag

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

En prekliniske modell for å vurdere Brain Recovery etter akutt hjerneslag i rotter

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Fokusert ultralydindusert blod-hjernebarriereåpning for å målrette hjernestrukturer og evaluere kjemogenetisk nevromodulering

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Hele neonatale cochleaeksplanter som en in vitro-modell

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

Registrering av barrierefunksjonell integritet på bEnd.3 Vaskulære endotelceller via deteksjon av transendotelial elektrisk motstand

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Rekonstruksjon av blod-hjernebarrieren in vitro for å modellere og terapeutisk målrette nevrologisk sykdom

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...