Name: generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model
Uploaded: 2012-08-29T13:00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model at JoVE.com

Denna forskning stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG enligt licensnummer FO 315/4-1 och DFG SFB 688.

1. Isolering av Brain mikrokärl <ol><li> För varje preparat använda 09:55 neonatala möss av båda könen (3-5 dagar gamla). </li><li> Avliva en mus enligt lokala IACUC / veterinär rekommendationer, ta bort hjärnan omedelbart och överföring till en petriskål innehållande följande lösning: 15 mM Hepes (pH 7,4), 153 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,3 mM CaCl 2 x 2H 2 O, 2,6 mM MgClz 2 x 6H 2 O, 1% (vikt / volym) BSA (nedan kallat buffert A). </li><li> Om inget annat anges, ska alla isoleringsförfaranden utföras vid rumstemperatur (RT) (22-24 ° C) under huv med laminärt flöde. Skär hjärnor (cerebrum utan cerebellum och hjärnstammen), efter avlägsnande av meningerna och kapillära fragment, i buffert A med användning av en steril skalpell. Pipettera vävnadsfragment upp och ner med hjälp av en 10 ml pipett tills inga klumpar visas. Överför suspensionen till ett 50 ml Falcon-rör och centrifugera vid 250 xg under 5 min vid RT. </li></ol> Obs: meninger kan identifieras som tunna, genomskinliga membran vid ytan av hjärnvävnaden. De kan avlägsnas försiktigt med steril tång. <ol start="4"><li> Kasta bort supernatanten. </li><li> Upplös pelleten i 4,5 ml buffert A med 1,5 ml 0,75% (vikt / volym) kollagenas / dispas (Roche) och inkubera under 45 minuter vid 37 ° C i ett vattenbad (ibland skakning). </li><li> Samtidigt förbereder 12-brunnsplattor genom beläggning fyra brunnar med kollagen IV (0,1 mg / ml upplöst i 50 mM ättiksyra). Låt vidhäfta under 1 timme. </li><li> Stoppa matsmältningen genom tillsats av 15 ml iskall buffert A. suspendera pelleten noggrant. </li><li> Centrifugera suspensionen vid 250 xg under 10 min vid RT. </li><li> Kasta bort supernatanten. </li><li> För att ta bort myelin, tillsätt 10 ml 25% (vikt / volym) BSA (Sigma, renhet&gt; 98%) och centrifugera vid 1.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C. 25% BSA bör lösas i 1 x PBS (PAA Laboratories) och filtrerades genom 0,2 pm fIlter). </li><li> Försiktigt kasta supernatanten, lös pelleten i 10 ml buffert A och överföra till ett nytt Falcon rör. </li><li> Centrifugera suspensionen vid 250 x g under 5 min vid RT. Den resulterande pelleten innehåller endotelcellerna. </li><li> Tvätta två gånger kollagen IV-belagda 12-brunnars platta med PBS. </li><li> Återsuspendera pelleten i 4 ml tillväxtmedium (DMEM innehållande 10% FCS, 50U/ml penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin) och plattan cellsuspensionen i två brunnar, 2 ml till varje brunn. Tillsätt puromycinet till en slutlig koncentration av 4 | ig / ml och inkubera 45 minuter vid 37 ° C i en cellkultur inkubator. Detta steg medger avlägsnande av snabbt vidhäftande celler Anm:. Puromycin tillsätts för 24 timmar. Endast hjärn EC kan metabolisera det, för andra celltyper puromycin är giftig 14. </li><li> Överför 2 ml medium innehållande icke-vidhäftande celler från steg 1,14 i två nya brunnar (dessa brunnar innehåller EG fraktionen). Fyll brunnarna med vidhäftade celler från stes. 1,14 med 2 ml färskt medium (dessa brunnar innehåller andra celltyper, t.ex. fibroblaster, astrocyter och kan odlas i parallellt och användes för jämförelser av morfologin). </li><li> Ändra mediet följande dag. </li></ol> 2. Odödliggöra hjärnan mikrovaskulära endotelceller <ol><li> Odla GP + E-86 Neo (GPENeo) 15 fibroblaster, som utsöndrar en replikationsdefekt virus bristfällig med polyom mellersta T-onkogenen i DMEM-medium innehållande 10% värmeinaktiverat FCS, 50U/ml penicillin / streptomycin, och 2 mg / ml G418 ( . PAA Laboratories) i gelatin belagda kolvar Notera: Polyoma mitten T onkogen transfektion orsakar tillväxt fördel av EC över icke-ECS leder till en homogen monoskikt av celler med endotel morfologi 4 till 6 veckor av kultur. GPENeo inte är kommersiellt tillgängliga och kan erhållas som delade offentligt material (se original publikationer 4,16). </li><li> För att använda virusinnehållande medium för<html> immortalisering, odla GPENeo cellerna i G418-fritt medium under 24 timmar. </li><li> Avlägsna 10 ml av GPEneo supernatanten och tillsätt Polybrene (hexadimetrinbromid) (Sigma) till en slutlig koncentration av 8 ug / ml, sterilisera genom 0,45 um filter för att avlägsna cellulära fragment. </li><li> Ta odlingsmediet från EG kulturerna beredda i del 1 och tillsätt 2 ml av GPEneo supernatant / Polybrene blandningen i brunnarna. Upprepa det nästa dag med en ny GPEneo supematant / Polybrene blandning Anmärkning:. Polybrene används för att göra porerna i cellväggen för att underlätta infektion med virala partiklar). </li><li> Avlägsna GPEneo supernatanten / Polybrene blandning följande dag, tvätta cellerna två gånger med PBS och underhålla cellerna i odlingsmedium ändra det var 3 dagar. Vid konfluens, dela cellerna 1:2 på kollagen IV-belagda plattor. </li><li> Normalt bör stabila cerebrala endotelceller (cEND) cellinjer erhållas 4-5 veckor senare. </li></ol>e &quot;&gt; 3. odla Brain mikrovaskulära endotelceller <ol><li> Tina cellerna från cryoaliquot i vattenbad och överföring i 15 ml-Falcon med 10 ml förvärmd medium. </li><li> Centrifugera suspensionen vid 250 x g under 5 min vid RT. </li><li> Avlägsna mediet, överför pelleten i kollagen IV belagda T 25 cm 2 cellkultur kolv med förvärmd tillväxtmedium (celldensitet för plätering bör vara minst 1 x 10 4 celler / ml). </li><li> Ändra medium nästa dag och efter att cellerna nått konfluens (vanligen efter 5 dagar) dela cellerna. </li></ol> 4. Uppdelning av cEND-celler (Obs! Delning bör göras en gång i veckan, undvika att dela Högre än 1:4). <ol><li> Avlägsna mediet, tvätta cellerna med PBS. </li><li> Tillsätt 3 ml varmt trypsin-EDTA-lösning (PAA Laboratories) (T 75 cm 2 kolv), inkubera vid 37 ° C och vänta tills cellerna skikt dispergeras (vanligtvis inom 5 till 15 min). </li><li> Tillsätt 5 ml Of odlingsmedium, pipettera upp och ned och förflyttas till en ny kollagen IV-belagd kolv. </li></ol> 5. Frysning av cEND-celler <ol><li> Erhålla cellsuspensionen som beskrivs i steg 4 </li><li> Centrifugera suspensionen vid 250 x g under 5 min vid RT. </li><li> Resuspendera cellpelleten (erhållen från 1 T 75 cm 2 kolv) i 6 ml frysmedium (95% tillväxtmedium, 5% DMSO). </li><li> Dela cellsuspensionen i fyra 1,5 ml kryo-alikvoter Anmärkning:. En kryo-alikvot kan seedas på T 25 cm 2 kolv. </li><li> Förvara kryo-alikvoter under flytande kväve ångtemperatur. </li></ol> cEND tillväxtmedium: 450 ml DMEM, 10% FCS, 10 L-glutamin ml, 2% MEM-kit, 2% NEAA, 10 ml natrium pyruvat, 50 U / ml penicillin / streptomycin 6. Representativa resultat De cEND och cerebEND celler kännetecknas av immunostainings av endotel ennd BBB markörer liksom av mätningar av transendoteliala elektriskt motstånd (TEER) och permeabilitet. Den cEND och cerebEND hade en morfologi som liknar primära kulturer av hjärnans ECS med monoskikt av tätt packade långsträckta celler som uppvisade tillväxthämning på sammanflödet. Cellerna uttryckte väl detekterbara nivåer av Claudin-5, occludin och VE-cadherin proteiner som lokaliserades vid cell-cell korsningar, såsom visas genom immunofluorescens (fig 3) 4,5. Odling cEND celler i serum-reducerad mediet ledde till en ökning av TEER (från 150 Qcm 2 i närvaro av 10% serum till 500 Qcm 2 i närvaro av 2% serum), som potentieras genom tillsats av hydrokortison (800 Qcm 2) eller insulin (1.000 Qcm 2) 4. Monoskikt av cEND odlade i serum-reducerad medium under 21 dagar hade TEER av 900 Qcm 2 (Figur 4). TEER mättes med användning av en sammansättninginnehåller ström-passerande och spänning-mätning elektroder (World precisionsinstrument). Som jämförelse har den primära mikrovaskulära hjärnan EC rapporterats ha Teer värden av 200-600 Qcm 2 och en kommersiellt tillgänglig muscellinje bEnd.3 hade Teer värden på 100-140 Qcm 2 (för senaste översyn se Abbot 2005 och Toth et al., 2011 17,18). Dessutom passage av makromolekyler, såsom icke-laddade FITC-dextraner av molekylmassor 4, 10, 70 och 500 kDa, eller fluorescein (300 Da) över monoskiktet av cEND i 2% FCS-medium differentiering över 4 timmar minskade jämfört med kontroll-celler upprätthålls i tillväxtmedium innehållande 10% FCS: var paracellulär flussmedel reduceras till 30% av kontrollceller för fluorescein, till 26% för FITC-dextraner 10 och 70 kDa, och flussmedel reducerades till 4,5% av kontrollceller för FITC -dextrtan 500 kDa. I likhet med Teer värden var permeabilitet på den lägsta nivån i cellerna som odlats i närvaro av glukocorticoids (GC) 4. I ytterligare studier identifierade vi glukokortikoid målgenerna, occludin, Claudin-5 och VE-cadherin i hjärnan vaskulära endotel 4,7,9. GC behandling ledde till en ökning av uttrycket av dessa proteiner och till omlagring av VE-cadherin till cytoskelettet. Den direkta GC-medierad reglering av tät korsningen proteiner occludin och Claudin-5 visas genom GC svarselement i sina promotorregioner 4,7,19. Dessutom Claudin-5 identifierades som en ny östrogen mål i vaskulär endotel 10. Endoteldysfunktion ligger bakom många olika sjukdomar. Vi odlade till cEND i syre / glukos deprivation (OGD) förhållanden. OGD ledde till störningar av BBB-funktionen, som kan spädas efter kombinerad behandling med GC och proteasomhämmare bortezomib 12. OGD villkor ledde till en kraftig ökning av glukosupptag och i uttrycket av glukos transporgor i cerebEND, vilket kan vara försvagat genom tillsats av MK801, en ​​icke-kompetitiv hämmare av NMDA-receptorn 13. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> Figur 1. Morfologi av hjärnans mikrovaskulära endotelceller (cEND) En vecka efter isolering. Ljusmikroskopi bilder togs under den 6x (A) och 15x (B) förstoring. De ö-formade kolonier av endotelceller är synliga. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> Figur 2. Morfologi av hjärnans mikrovaskulära endotelceller (cEND) en månad efter isolering och immortalisering. Ljusmikroskopi bilder togs under 15x förstoring. En konfluent, homogen endotelcell monoskikt kan observeras. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> Figur 3. Immortaliserade hjärna microvascular endotelceller uttrycker Claudin-5, occludin och VE-cadherin. CEND celler odlades på kollagen IV-belagda täckglas och färgades med antikroppar mot Claudin-5 (A), occludin (B) och VE-cadherin (C). Bilderna togs med en Zeiss Axioscop2 mikroskop under 40x förstoring. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> Figur 4. Mätning av transendoteliala elektriskt motstånd (TEER) i cEND monolager. CEND odlades på kollagen IV-belagda Transwell filter (porstorlek 0,4 um). Efter nått konfluens, cellerna upprätthölls i medium innehållande 2% FCS. TEER mättes efter 7, 14 och 21 dagar med en enhet som innehåller ström-passerande och spänning-mätning elektroder.

<ol>
	<li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier.">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113 (2011).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier.">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937 (2008).</li><li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872 (2005).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).</li><li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli.">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37 (2006).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific.">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).</li><li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter.">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19 (2009).</li><li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND.">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937 (2007).</li><li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells.">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139 (2008).</li><li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium.">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298 (2010).</li><li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis.">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293 (2010).</li><li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome.">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081 (2011).</li><li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen/glucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells.">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44 (2012).</li><li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279 (2005).</li><li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells.">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203 (2002).</li><li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+function+of+the+blood-brain+barrier:+incomplete+presentation+of+protein+(auto-)antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro.">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757 (1990).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CNS+barriers:+evolution,+differentiation,+and+modulation.">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5 (2005).</li><li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery.">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107 (2011).</li><li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element.">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39 (2008).</li><li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses.">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125 (1994).</li><li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases.">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100 (1994).</li><li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation.">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327 (2001).</li><li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521 (1990).</li><li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells.">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101 (1994).</li><li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435 (1990).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315 (2010).</li><li>Skaper, S. D., Conn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neurosciences. 2, 1303 (1990).</li><li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin,+an+endothelial+anticoagulant+protein,+is+absent+from+the+human+brain.">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362 (1986).</li><li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis.">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540 (2003).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Det beskrivna förfarandet kan användas för isolering av mikrovaskulära ECS från olika musstammar samt från olika knock-out musstammar att studera specifika förändringar i vaskulärt endotel funktion. Som en metod för immortalisering vi använde transformation med onkoprotein av murint polyomavirus, Polyoma mellersta T-antigen. Det omvandlar snabbt omogna endotelceller in vivo och in vitro 20,21,22. Andra metoder för odödliggörande av EC beskrivna i litteraturen innefattar exempelvis immortalisering med SV40 stort T-antigen av Simian Virus vakuoliserande 40 23, adenovirus genprodukt E1A 24 eller överuttryck av den katalytiska subenheten av humant telomeras 3. Det immortalisering med PymT är specifik för den murina omogna EC, som gör det möjligt att få en homogen EG kultur från neonatala möss i en kort tid. Immortalisering förändrar egenskaperna hos cellerna och the resultat som erhållits med odödliga cellinjer ska jämföras antingen med primära celler eller med experiment in vivo med möss. PymT förevigat EG har beskrivits för att uttrycka höga nivåer av fibrinolytisk aktivitet till följd av ökad produktion av urokinastyp plasminogenaktivator och minskad produktion av plasminogenaktivator-hämmare 25. Direkt jämförelse av PymT immortaliserad bEND5 cellinjen med primär ECS avslöjade att både in vitro-modeller BBB väl lämpade för T-studier cell adhesion 26. De cellinjer som fastställts i enlighet med det beskrivna förfarandet kan användas vid låg passage nummer för att upprätthålla barriäregenskaper genom hög expression av BBB och EG Junktional proteiner som cellerna förlorar dessa egenskaper under åldrandet. Sålunda efter förlust av barriäregenskaper, bör beredning av en ny cellinje övervägas. Cell plätering densitet bör vara hög för ECS, eftersom detta är avgörande för celltillväxt. Detta måste beaktas vid isoleringsförfarandet samt underhåll av förevigade ECS. Varje ny cellinje bör testas för dess barriäregenskaper och för eventuella föroreningar med andra celltyper. EG monoskikt kan färgas med anti-galaktocerebrosid, anti-gliafibrillärt surt protein och anti-glatt muskulatur antigen som primära antikroppar för att utesluta förorening med oligodendrocyter, astrocyter och pericyter 4,27. För att utesluta förorening med meningal vaskulatur, kan expressionen av trombomodulin testas, som uttrycks i alla vaskulära bäddar med undantag av hjärnan 28. Intressant de odödliggjorda mikrovaskulära endotelceller cellinjer som isolerats från olika hjärnregioner skiljer sig åt i barriäregenskaper och känslighet för pro-inflammatoriska stimuli. Som ett exempel, kan de cerebrala cEND och cerebellär cerebEND cellinjer nämnas 4,5. CerebEND visade, i jämförelseatt cEND, lägre uttrycksnivåer av större snäva junction komponenter Claudin-1 och occludin. Emellertid var nivåerna av Claudin-3 och -12 högre cerebEND. Den barriärfunktion cerebEND celler lidit mycket mer under en behandling med inflammatorisk mediator, TNFa än barriäregenskaper cEND celler gjorde 5. Högre cerebellär sårbarhet för inflammatoriska stimuli, kan observeras in vivo i patienter med multipel skleros och i sin djurmodell experimentell autoimmun encefalomyelit 29. Dessa intressanta resultat visar behovet av generering och karakterisera individ in vitro-modeller för olika hjärnregioner, för att förbättra den framtida målsökande in i hjärnan.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Renhet&gt; 98% </td></tr><tr><td> kollagen IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5533 </td><td> 50 pg / ml i 50 mM ättiksyra </td></tr><tr><td> Kollagenas / Dispase </td><td> Roche </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt kalvserum (FCS) </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15110-1333 </td><td> slutlig koncentration 10%, värmeinaktiverat (30 min vid 56 ° C) </td></tr&gt; <tr><td> L-glutamin </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> Lagring: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamin </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> Lagring: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Na-pyruvat </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> Neomycin (G418) </td><td> PAA Laboratories </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> Icke-essentiella aminosyror (NEA) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> Lagring vid 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilin / streptomycin </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> Lagring: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybren (hexadimetrinbromid) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 107.689 </td><td> 0,8 mg / ml i PBS, förvaring vid -20 ° C </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0,05%, 0,02% EDTA i PBS </td></tr></tbody></table>

generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model

Epitel-och endotelceller (EG) bygger paracellulära barriärer som skyddar vävnad från yttre och inre miljö. Blod-hjärnbarriären (BBB) ​​som består av EG astrocyt end-fötter, pericyter och basala membranet är ansvarig för att skydda och homeostas av hjärnparenkymet. In vitro BBB modeller är gemensamma verktyg för att studera struktur och funktion BBB på cellnivå. Ett stort antal olika in vitro BBB modeller har fastställts för forskning i olika laboratorier hittills. Vanligtvis är cellerna erhållna från nötkreatur, svin, råtta eller mus hjärnvävnad (diskuteras i detalj i översikten av Wilhelm et al. 1). Mänskliga vävnadsprover finns endast i ett begränsat antal laboratorier eller företag 2,3. Medan primära cellpreparat är tidskrävande och EG kulturer kan skilja sig från parti till parti, inrättandet av odödliggjorda EG lines är i fokus för vetenskapligt intresse. Här presenterar vi en metod för att fastställa en odödlig hjärna mikrovaskulära EG linje från neonatal mus hjärna. Vi beskriver proceduren steg för steg lista de reagenser och lösningar som används. Den metod som inrättas genom vårt labb tillåter isolering av en odödlig homogen endotelial cellinje inom 4-5 veckor. Hjärnan mikrovaskulära endotelceller cellinjer benämns cEND 4 (från hjärnbarken) och cerebEND 5 (från cerebellar cortex), isolerades enligt detta förfarande i Förster laboratoriet och har faktiskt använts för förklaring av olika fysiologiska och patologiska processer i BBB. Använda cEND och cerebEND vi har visat att dessa celler svarar på glukokortikoid-4,6-9 och östrogen behandling 10 samt till pro-infammatory mediatorer, såsom TNFalpha 5,8. Dessutom har vi studerat patologi multipel SClerosis 11 och hypoxi 12,13 på EG-nivå. Den cEND och linjer cerebEND kan betraktas som ett bra verktyg för att studera struktur och funktion av BBB, cellulära svaren av ECS till olika stimuli eller samverkan mellan EG med lymfocyter eller cancerceller.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model at JoVE.com

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Denna metod beskriver hur man isolera och odödliggöra mikrovaskulära endotelceller från mus hjärna. Vi beskriver ett steg-för-steg-protokoll utgående från homogenisering av hjärnvävnaden, steg matsmältning, sådd och immortalisering av cellerna. Vanligtvis tar det cirka fem veckor att få en homogen, förevigat mikrovaskulär endotelceller linje.

Generering av en immortaliserad Murine Brain Microvascular Endothelial cellinje som<em&gt; In Vitro</em&gt; Blod-hjärnbarriären Modell

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolering av Primär Murina Brain mikrovaskulära endotelceller

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Gränssnitt 3D Engineered neuronala kulturer Micro-Elektrod arrayer: Ett innovativt<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimentellt

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

En In Vivo blod - hjärnbarriären permeabilitet test på möss med Fluorescently märkt spårämnen

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

En In Vivo -bedömning av blod - hjärnbarriären störningar i en råtta modell av ischemisk Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

En preklinisk modell för att bedöma hjärn återhämtning efter akut stroke hos råttor

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Fokuserad ultraljudsinducerad blod-hjärnbarriäröppning för att rikta in sig på hjärnstrukturer och utvärdera kemogenetisk neuromodulering

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Hela neonatala cochleaexplantat som en in vitro-modell

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

Registrering av barriärfunktionell integritet på bEnd.3 vaskulära endotelceller via transendotelial elektrisk motståndsdetektering

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Rekonstruktion av blod-hjärnbarriären in vitro för att modellera och terapeutiskt rikta in sig på neurologiska sjukdomar

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...