Name: induction of adhesion-dependent signals using low-intensity ultrasound
Uploaded: 2012-05-08T13:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound at JoVE.com

Эта работа была поддержана Wellcome Trust грант в 088 419 МБР и спонсорство Smith &amp; Nephew Великобритании ООО

<ol>
	<li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syndecan-4+hair+trigger+initiates+wound+healing+through+caveolin-+and+RhoG-regulated+integrin+endocytosis.">A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis.</a> Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).</li><li>Echtermeyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+repair+and+impaired+angiogenesis+in+mice+lacking+syndecan-4.">Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4.</a> J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).</li><li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-4-dependent+Rac1+regulation+determines+directional+migration+in+response+to+the+extracellular+matrix.">Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix.</a> J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).</li><li>Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+cytoskeletal+organisation+of+fibroblasts+in+response+to+fibronectin+fragments.">Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments.</a> Embo. J. 5, 665-670 (1986).</li><li>Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+ultrasound+bypasses+canonical+syndecan-4+signaling+to+activate+rac1.">Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1.</a> J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).</li><li>Claes, L., Willie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enhancement+of+bone+regeneration+by+ultrasound.">The enhancement of bone regeneration by ultrasound.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).</li><li>Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+tibial+fracture-healing+by+non-invasive,+low-intensity+pulsed+ultrasound.">Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).</li><li>Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+healing+of+distal+radial+fractures+with+the+use+of+specific,+low-intensity+ultrasound.+A+multicenter,+prospective,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study.">Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).</li><li>Danen, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+the+synergy+site+for+cell+adhesion+to+fibronectin+depends+on+the+activation+state+of+integrin+alpha+5+beta+1.">Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).</li><li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK.">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).</li><li>Makarem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+binding+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+and+the+HepII/IIICS+domain+of+fibronectin+to+the+integrin+alpha+4+beta+1.">Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).</li></ol>

Эндрю Харрисон сотрудник Smith &amp; Nephew Великобритании Limited.

В этом протоколе описываются способ, которым лечение, которое обычно применяется для человека пациенты могут быть использованы в клеточных экспериментов. Конечная цель заключается в понимании молекулярного механизма действия ультразвука, так что лечение может быть уточнена. В этом протоколе, мы используем мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) как систему ячейка модели, но ультразвук был также признан эффективным в первичных человеческих фибробластов крайней плоти 5, мезенхимальные стволовые клетки, остеобласты и хондроциты 6. Мы используем Rac1 активации, например, биохимический анализ, но метод может быть использован в равной степени для проверки регулировании фосфорилирования белка или образование белковых комплексов по иммунопреципитации. Для иммунофлуоресцентного примере продемонстрировать влияние ультразвука на координационных спаек, но перераспределение любая молекула может быть рассмотрена. Например, можно проверить набор цитозольного факторов плазматической мембраны, colocalisation из proteмодулей в торговле пузырьки или изучения влияния ультразвука на митотический организации шпинделя. До сих пор мы ограничивались тестирование фибронектина зависит от пути, под действием ультразвука на клетки на коллаген, или в присутствии факторов роста могут быть проверены создать картину того, как ультразвук влияет на поведение клеток в сложных условиях, что более напоминает ситуацию в естественных условиях. Более сложной задачей будет проверить влияние ультразвука использованием покадровой обработки изображений, где присутствие эмитента блокирует путь света и вибраций от ультразвукового настоящее время дополнительные технические трудности. Тем не менее, тот факт, что терапевтическое применение требует только 20 минут в день стимуляция предполагает, что анализ поведения клеток после взрыва стимуляция может быть продуктивным.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии (опционально) </td></tr><tr><td> сульфо-м-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide эфир </td><td> FisherPerbio </td><td> PN22312 </td><td> 25 мМ запасы растворенного в воде можно хранить при температуре -20 ° C </td></tr><tr><td> 6-и культуре тканей пластины </td><td> Гранулирование </td><td> 3516 </td><td> Пластиковые от других компаний могут покрыть плохо </td></tr><tr><td> 13-мм стекло покровное </td><td> Научно-исследовательская лаборатория Поставки Ltd.SLS </td><td> MIC3336 </td><td> Стекло с другими компаниями могут покрыть плохо </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Сигма </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, Ca 2 + Mg 2 + </td><td> Сигма </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> 50K интегрина лигандом (фибронектином фрагмент) </td><td> Построить описание и предварительноторных в 9, 11 </td><td></td><td> Альтернативные лигандов матрица может быть использована для допроса других путей </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Сигма </td><td> A3059 </td><td></td></tr><tr><td> Циклогексимида </td><td> Сигма </td><td> C7698 </td><td> Может быть сохранены как 10mg/ml акции в воде </td></tr><tr><td> DMEM/25 мМ HEPES </td><td> Сигма </td><td> D6171 </td><td></td></tr><tr><td> Exogen 4000 + </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ультразвуковой гель связи </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SAFHS индикатор </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hVIN-1 </td><td> Сигма </td><td> V9264 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 сопряженные анти-мышь </td><td> Stratech Научные </td><td> 715-485-150 </td><td></td></tr><tr><td> TRITC меченных фаллоидином &lt;/ TD&gt; <td> Сигма </td><td> P1951 </td><td></td></tr><tr><td> Продлить Золото реагент antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> полный ингибитор протеазы (EDTA бесплатно) </td><td> Roche </td><td> 056 489 001 </td><td> 100 × акции состоит из планшета хранить при температуре -20 ° C </td></tr><tr><td> ПАК-глутатион агарозном бисера </td><td> Построить описание и подготовка в 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Глицерин </td><td> Рыбак </td><td> G/0650/17 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Apollo Научные </td><td> BI8181 </td><td> Сделать 1М акций и рН до 7,4 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Рыбак </td><td> S/0160/65 </td><td></td></tr><tr><td> NP40 </td><td> Сигма </td><td> I3021 </td><td></td></tr><tr><td> Натрий Deoxycholate </td><td> Сигма </td><td> D6750 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Сигма </td><td> E4378 </td><tг&gt; </td></tr><tr><td> ЭДТА </td><td> Сигма </td><td> E5134 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of adhesion-dependent signals using low-intensity ultrasound

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from regulation of cell migration and proliferation, to secretion and even differentiation. The signals underlying each of these complex processes arise from the molecular interactions of extracellular matrix receptors on the surface of the cell. Integrins are the prototypic receptors and provide a mechanical link between extracellular matrix and the cytoskeleton, as well as initiating some of the adhesion-dependent signaling cascades. However, it is becoming increasingly apparent that additional transmembrane receptors function alongside the integrins to regulate both the integrin itself and signals downstream. The most elegant of these examples is the transmembrane proteoglycan, syndecan-4, which cooperates with &alpha;5&beta;1-integrin during adhesion to fibronectin. In vivo models demonstrate the importance of syndecan-4 signaling, as syndecan-4-knockout mice exhibit healing retardation due to inefficient fibroblast migration1,2. In wild-type animals, migration of fibroblasts toward a wound is triggered by the appearance of fibronectin that leaks from damaged capillaries and is deposited by macrophages in injured tissue. Therefore there is great interest in discovering strategies that enhance fibronectin-dependent signaling and could accelerate repair processes.
The integrin-mediated and syndecan-4-mediated components of fibronectin-dependent signaling can be separated by stimulating cells with recombinant fibronectin fragments. Although integrin engagement is essential for cell adhesion, certain fibronectin-dependent signals are regulated by syndecan-4. Syndecan-4 activates the Rac1 protrusive signal3, causes integrin redistribution1, triggers recruitment of cytoskeletal molecules, such as vinculin, to focal adhesions4, and thereby induces directional migration3. We have looked for alternative strategies for activating such signals and found that low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) can mimic the effects of syndecan-4 engagement5. In this protocol we describe the method by which 30 mW/cm2, 1.5 MHz ultrasound, pulsed at 1 kHz (Fig. 1) can be applied to fibroblasts in culture (Fig. 2) to induce Rac1 activation and focal adhesion formation. Ultrasound stimulation is applied for a maximum of 20 minutes, as this combination of parameters has been found to be most efficacious for acceleration of clinical fracture repair6. The method uses recombinant fibronectin fragments to engage &alpha;5&beta;1-integrin, without engagement of syndecan-4, and requires inhibition of protein synthesis by cycloheximide to block deposition of additional matrix by the fibroblasts., The positive effect of ultrasound on repair mechanisms is well documented7,8, and by understanding the molecular effect of ultrasound in culture we should be able to refine the therapeutic technique to improve clinical outcomes.

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound at JoVE.com

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Этот протокол описывает стимуляции культуре фибробластов с низкой интенсивностью импульсного ультразвука, который управляет координационный спаек и Rac1 активации, имитируя участие рецепторов трансмембранного матрицы, syndecan-4. Такой подход позволяет исследовать успешные клинические техники на клеточном уровне, обеспечивая тем самым возможности для уточнения терапии.

Индукция Адгезия зависит от сигналов с низкой интенсивности ультразвука

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

Контрастность Ультразвуковое целенаправленного лечения глиом у мышей с помощью наркотиков принимая доставки наночастиц и микрососудистой абляции

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

Введение в Ультразвуковое Целевые микропузырьков Техника Уничтожение

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Широкополосный оптический детектор ультразвука для медицинской визуализации приложений

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

Мониторинг в реальном времени высокой интенсивности сфокусированного ультразвука (HIFU) абляции<em&gt; In Vitro</em&gt; Собаки Печень Использование Harmonic Motion визуализации для сфокусированного ультразвука (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

Передача нескольких сигналов по оптическому волокну с использованием Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...

An Experimental Protocol for Assessing the Performance of New Ultrasound Probes Based on CMUT Technology in Application to Brain Imaging

Экспериментальный протокол для оценки эффективности новых ультразвуковые датчики, основанные на CMUT технологии в применении к томографии мозга

The possibility to perform an early and repeatable assessment of imaging performance is fundamental in the design and development process of new ...

Manufacturing Abdominal Aorta Hydrogel Tissue-Mimicking Phantoms for Ultrasound Elastography Validation

Производство, брюшной аорты гидрогеля ткани подражая фантомы для проверки ультразвуковая эластография

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Пациент-специфический поливинил Алкоголь Фантом Изготовление с ультразвуком и рентгеновским контрастом для планирования хирургии опухоли головного мозга

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Функциональное транскраниальное допплерография для мониторинга мозгового кровотока

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation (SHAPE) Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation SHAPE Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

Субгармоническая оценка давления с контрастным усилением (SHAPE) с использованием ультразвуковой визуализации с акцентом на выявление портальной гипертензии

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound ...