Name: induction of adhesion-dependent signals using low-intensity ultrasound
Uploaded: 2012-05-08T13:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Wellcome Trust bidrag 088.419 till MDB och sponsring av Smith &amp; Nephew Storbritannien Ltd

1. Beläggning Ytor med Matrix-ligand <ol><li> Ultraljud kommer att tillämpas på celler i 3,5-cm brunnar, antingen som individuella skålar eller en 6-brunnsplatta. För biokemiska analyser, kappa liganden direkt på plasten. För immunofluorescens, täckglas koka glas tre gånger i MilliQ vatten och placera 4 täckglas i botten av varje brunn. </li><li> Glasytor måste vara derivatiseras att säkerställa en effektiv ligand beläggning. Lös sulfo-m-maleimidobensoyl-N-hydrosuccinimide ester i PBS vid 1 mM. Tillsätt 2 ml till varje brunn och inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur. </li><li> Tvätta de derivatiserade ytorna 3 gånger med PBS. </li><li> Coat antingen derivatiserade glas eller obehandlad plast med integrin ligand. Tillämpas 2 ml 10 pg / ml integrin ligand9, löst i PBS innehållande Ca2 + och Mg2 +-till varje brunn och inkubera över natten vid 4 ° C. </li><li> Framställ monoparticulate BSA genom upphettning 1% BSA, löst i PBS, till 85 ° C under 13 minuter. Tillåtasvalna och sedan passera genom en 0,45 | im filter. </li><li> Tvätta ligand-belagda ytor 3 gånger med PBS och blockera med monoparticulate BSA under 30 minuter. </li></ol> 2. Beredning av celler <ol><li> Att styra matrisen miljön under hela experimentet, bör proteinsyntes blockeras genom tillsats av 25 | ig / ml cykloheximid till 80% konfluenta fibroblaster under 2 timmar. </li><li> Skölj cykloheximid-behandlade celler med PBS och lossas från odlingskolven med användning av 0,5 mg / ml trypsin / EDTA. </li><li> Skörd lösgjorda cellerna genom centrifugering vid 500 X g under 5 minuter. </li><li> Återsuspendera cellerna i DMEM/25 mM HEPES, 25 | ig / ml cykloheximid. </li><li> Räkna celltäthet av suspensionen med användning av en hemocytometer och späds till 105 ml-1. </li><li> Inkubera cellerna vid 37 ° C under 20 minuter för att utvinna yta integrin. </li><li> Skölj-ligand-belagd, BSA-blockerade brunnarna 3 gånger med PBS. </li><li> Frö 2 ml av cellsuspensionen i varje brunn. </li><li> Allow cellerna att kunna spridas i 2 timmar vid 37 ° C, 5% CO2. </li></ol> 3. Ultraljud Stimulering <ol><li> Värm arrayen ultraljud emitter och koppling gel till 37 ° C. </li><li> Applicera en ärtstora klump av koppling gel till varje sändare. </li><li> Testa att varje sändare är funktionell med en ultraljud-detektor indikeringsdioden. </li><li> Placera brunnarna på emittern matrisen. Återgå matris till 37 ° C, 5% CO2 och tillåta temperaturen att jämvikta i 10 minuter. </li><li> Slå på ultraljudssignalen. </li><li> Ultraljudssignalen avaktiveras efter 20 minuter, som imiterar den terapeutiska regimen. Om kortare stimulering tider krävs skall tallrikar tas bort från arrayen vid rätt tidpunkt-poäng. I samtliga fall använda ostimulerad plattor som den negativa kontrollen. </li></ol> 4. Focal Adhesion Analys med immunofluorescens <ol><li> För analys av fokal adherensbildning, tillämpa 20-minuters ultraljudssignalenoch sedan låta strukturer för att utveckla under ytterligare 40 minuter med bibehållande celler vid 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Aspirera media och fixera cellerna genom att tillämpa 2 ml 4% paraformaldehyd i PBS. Inkubera under 14 minuter vid rumstemperatur. </li><li> Aspirera paraformaldehyd och skölj tre gånger med PBS, med tillämpning av PBS försiktigt ner kanten av brunnen för att undvika generering av skjuvkrafter. </li><li> Överför varje täckglas från 3,5 cm brunn till en 24-brunnsplatta för efterföljande immunfluorescerande färgning. </li><li> Släcka återstående paraformaldehyd genom applicering 0,5 ml 0,1 M glycin i PBS till varje av de 24 brunnarna. Inkubera under 20 minuter vid rumstemperatur. </li><li> Sug glycin och skölj tre gånger med PBS. </li><li> Permeabilisera celler genom att applicera 0,5 ml 0,5% Triton X-100 (vikt / volym) i PBS. Inkubera under 4 minuter vid rumstemperatur. </li><li> Sug Triton X-100 och skölj tre gånger med PBS. </li><li> Blockera genom applicering 0,5 ml 3% (vikt / volym) BSA i PBS. Inkubera över natten vid 4 &amp; dt.ex., C. </li><li> Stain vinkulin innehållande fokal adhesion med hVIN-1-antikropp utspädd 1:400 i BSA block. Inkubera under en timme vid rumstemperatur. </li><li> Skölj tre gånger med PBS. </li><li> Tillämpas fluorofor (DyLight 488)-konjugerad sekundär antikropp (spädd 1:200) och fläcken aktin med TRITC-falloidin konjugerad (utspädd 1:200) i BSA-block. Inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur. </li><li> Skölj tre gånger med PBS och en gång med vatten. </li><li> Montera på en glasskiva i en inverterad position med hjälp Förläng guld monteringsvätska. </li></ol> 5. Kvantifiering av RAC1 Aktivering av Pull-down-analys <ol><li> För analys av RAC1 aktivering, applicera den 20-minuters ultraljudssignalen till celler vid 37 ° C, 5% CO2. Vid bedömning av respons gånger längre än 20 minuter, applicera ultraljud signalen under 20 minuter och bibehålla cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 under återstående tid för att tillåta reaktion på att utvecklas. </li><li> Aspirera media och plats samts på is. Skölj brunnar med 2 ml kall PBS och aspirera. Se till att alla kvarvarande PBS avlägsnas genom att lämna brunnar vinklas för 1 minut följt av noggrann aspiration. </li><li> Lyserar celler på is med 35 pl lysbuffert (10% glycerol, 20 mM Hepes pH 7,4, 140 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% natriumdeoxikolat, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 x fullständig proteasinhibitor) per brunn. I detta exempel är 6 brunnar användes per tidpunkt för att generera 210 | il av cellysatet. Fler eller färre brunnar kan användas, men den totala lysatet volym bör uppgå ~ 200 | il. </li><li> Skrapa celler grundligt med cellskrapa för att säkerställa fullständig cell-lys och lämna brunnar lutas i 1 minut för att lysat att slå. </li><li> Överföra lysatet till en iskall 1,5 ml mikrofugrör (pooling lysat från samma behandlingskur) och centrifugering vid 21 tusen x g under 2 minuter vid 4 ° C för att pelletera cellrester. </li><li> Överföra 180 pl av lysat till iskall 1,5-ml mikrocentrifugrör innehållande 130 | il lysbuffert och 25 | il PAK-glutathione agarospärlor 10. Hålla kvar råa lysatet vid -20 ° C för efterföljande gelseparation. </li><li> Fånga aktiva RAC1 på PAK-glutation-agaroskulor genom att rotera rören under 40 minuter vid 4 ° C. </li><li> Skörd agaros vulst konjugat genom centrifugering vid 2000 x g under 1 minut vid 4 ° C. </li><li> Tvätt vulst konjugat tre gånger med 500 pl lysbuffert, skörd pärlorna genom centrifugering vid 2000x g och kasta supernatanten efter varje tvätt. Ta försiktigt bort eventuellt kvarvarande buffert lys tvätta med en 200 ^ pipett. </li><li> Eluera varje prov genom att tillsätta 35 | il SDS-PAGE-laddningsbuffert och inkubera vid 85 ° C på en skakande värmeblock under 5 minuter. Avlägsna pärlorna genom centrifugering vid 21 tusen x g under 1 minut. </li><li> Lös vulst eluat med SDS-PAGE, överföring till nitrocellulosa och sonden för RAC1. </li></ol> 6. Representativa resultat I detta protokoll beskriver vi induktion av vinkulin-fläcked fokala sammanväxningar och RAC1 aktivitet med ultraljud. För i fokus vidhäftning experiment är baslinjen position som fibroblaster sprids på ett ligand α 5 β 1-integrin inte utgör vinkulin innehåller sammanväxningar (Fig. 3A) om en andra fibronektinreceptor, syndekan-4, är engagerad genom tillsats av löslig ligand (figur 3B) 3,4. Emellertid inducerar stimulering med ultraljud fokal adherensbildning i samma utsträckning som ingrepp av syndekan-4 (fig. 3C), vilket indikerar att ultraljud stimulering kan ersätta vissa komponenter i det fibronektin-beroende signalväg 5. Nyckeln hindret med detta protokoll eliminera fokus adherensbildning i frånvaro av stimulerande. Ofullständig inhibering av proteinsyntes genom cykloheximid tillåter matrixdeposition som är tillräcklig för att cellerna skall automatiskt stimulera. Överbeläggning av celler kan också leda till låg nivå fokus vidhäftning Formation och ett dåligt svar på ultraljud som överhörning mellan cell-cell-och cell-matrix kontakter kommer att komplicera ett experiment som utformats för att isolera en enda stimulus. Som en utveckling av den grundläggande analysen visar vi samma experiment, upprepas med fibroblaster som saknar syndekan-4 (Fig. 4). Dessa fibroblaster reagera fortfarande för ultraljud (fig. 4C), men misslyckas med att svara på syndekan-4-ligand (figur 4B). Experimentet med Sdc4 - / - fibroblaster visar att ultraljud faktiskt kan kringgå behovet av vissa fibronektinreceptorer, och illustrerar hur enkelt protokoll kan utvecklas för att få extra information om signalväg. För biokemiska experiment visar vi att ultraljud kan inducera aktivering av RAC1, med användning av en neddragningstransistor immunanalys som en anpassning av metoden beskriven av del Pozo et al. 10. Utfällning av aktivt RAC1 0, 10, 30 och 60 minuter efter ini-differentiering av ultraljud stimulering avslöjar att RAC1 aktivitet toppar vid 10-30 minuter, innan han återvände till baslinjen (Fig. 5). Blotting rålysat för vinkulin ger lastutrymme motsvarande mellan tidpunkter. Resultatet liknar aktiveringen av RAC1 genom ingrepp av syndekan-4 3, men är något mer utdragen än aktivering av fibronektin. Därför 8-10 upprepningar är vanligtvis krävs för att uppnå betydande data. Aktivering av RAC1 är ansvarig för åtagande av celler till fokal adherenser, och begynnande fokala sammanväxningar börjar bildas vid 10-30 minuter, vilket sammanföll med RAC1 aktivering. En gång påbörjats, kommer dessa adhesioner fortsätter att mogna till de stora adhesion plack som visas i figurerna 3 och 4. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig1.jpg" /> Figur 1. Ultraljudet vågform. Ultraljud innefattar en intermittent 1,5 MHz-signalen som beror på låg amplitud (30 mW / cm &lt;sup&gt; 2, har rumslig genomsnitt temporal genomsnitt) ingen uppvärmning effekt. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig2.jpg" /> Figur 2. Schematisk representation av arbetsflödet för framställning och stimulering av celler med ultraljud. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig3.jpg" /> Figur 3. Ultraljud induktion av fokal adherensbildning i fibroblaster. Fibroblaster spreds på integrin-bindande fragment av fibronektin (A) före stimulering med syndekan-4-bindande fragment av fibronektin (B) eller ultraljud (C). Efter 60 minuters stimulering fixerades celler, färgades för vinkulin och aktin, och avbildas av epifluorescens. Bar = 10 pm. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig4.jpg" /> Figur 4. Ultraljud induktion av fokal adherensbildning i fibroblaster som saknar syndekan-4. <em&gt; Sdc4 - / - fibroblaster spreds på integrin-bindande fragment av fibronektin (A) före stimulering med syndekan-4-bindande fragment av fibronektin (B) eller ultraljud (C). Efter 60 minuters stimulering fixerades celler, färgades för vinkulin och aktin, och avbildas av epifluorescens. Även Sdc4 - / - fibroblaster var fibronektin-okänsliga, ultraljud inducerade fortfarande fokus adherensbildning, vilket tyder på att ultraljud förbi matrix receptor engagemang. Bar = 10 pm. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig5.jpg" /> Figur 5. Aktivering av RAC1 med ultraljud. Cellerna stimulerades under 0, 10, 30 och 60 minuter med 6 brunnar användes per tidpunkt. Mängden av GTP-RAC1 närvarande i prover från en RAC1 pull-down-analys tidsförloppet visualiserades genom inkubation med anti-RAC1 antikropp på en western blöt (övre bilden). Kvantifiering av bandet intensitet (i genomsnitt 8-10 replikat) visar ökade RAC1 enctivity följd av ultraljud signal vid 10 och 30 minuter, innan han återvände till baslinjenivåer vid 60 minuter (graf). Felstaplar utgör SEM

<ol>
	<li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syndecan-4+hair+trigger+initiates+wound+healing+through+caveolin-+and+RhoG-regulated+integrin+endocytosis.">A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis.</a> Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).</li><li>Echtermeyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+repair+and+impaired+angiogenesis+in+mice+lacking+syndecan-4.">Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4.</a> J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).</li><li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-4-dependent+Rac1+regulation+determines+directional+migration+in+response+to+the+extracellular+matrix.">Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix.</a> J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).</li><li>Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+cytoskeletal+organisation+of+fibroblasts+in+response+to+fibronectin+fragments.">Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments.</a> Embo. J. 5, 665-670 (1986).</li><li>Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+ultrasound+bypasses+canonical+syndecan-4+signaling+to+activate+rac1.">Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1.</a> J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).</li><li>Claes, L., Willie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enhancement+of+bone+regeneration+by+ultrasound.">The enhancement of bone regeneration by ultrasound.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).</li><li>Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+tibial+fracture-healing+by+non-invasive,+low-intensity+pulsed+ultrasound.">Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).</li><li>Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+healing+of+distal+radial+fractures+with+the+use+of+specific,+low-intensity+ultrasound.+A+multicenter,+prospective,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study.">Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).</li><li>Danen, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+the+synergy+site+for+cell+adhesion+to+fibronectin+depends+on+the+activation+state+of+integrin+alpha+5+beta+1.">Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).</li><li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK.">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).</li><li>Makarem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+binding+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+and+the+HepII/IIICS+domain+of+fibronectin+to+the+integrin+alpha+4+beta+1.">Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).</li></ol>

Andrew Harrison är en anställd hos Smith &amp; Nephew Storbritannien Limited.

I detta protokoll beskriver vi den metod med vilken en behandling, som normalt appliceras på humana patienter kan användas i cellbaserade försök. Det slutliga målet är att förstå den molekylära mekanismen för ultraljud åtgärder så att den behandlingen kan förfinas. I detta protokoll använder vi mus embryonala fibroblaster (MEF) som modell cellsystem, men ultraljud har också visat sig vara effektiva i primära humana förhudsfibroblaster 5, mesenkymala stamceller, osteoblaster och kondrocyter 6. Vi använder RAC1 aktivering som exempel biokemisk analys, men den metod skulle kunna användas på samma sätt för testa reglering av proteinfosforylering eller bildning av protein-komplex genom immunoutfällning. För immunofluorescens exemplet visar vi en effekt ultraljud fokus adherensbildning, men omfördelning av vilken molekyl som helst kan undersökas. Exempelvis kan man testa rekrytering av cytosoliska faktorer till plasmamembranet, colocalisation av proteprogram i människohandel blåsor eller undersöka effekten av ultraljud på mitotisk spindel organisation. Hittills har vi begränsat oss till att testa fibronektin-beroende vägar, genom effekten av ultraljud på celler på kollagen, eller i närvaro av tillväxtfaktorer kan testas för att bygga upp en bild av hur ultraljud påverkar cellens beteende i en komplex miljö som mer liknar en in vivo-situationen. En större utmaning blir att testa effekten av ultraljud att använda time-lapse avbildning, där närvaron av sändaren blockerar ljuset vägen och vibrationer från ultraljud nuvarande ytterligare tekniska hinder. Tyder dock på det faktum att terapeutiska applikationen kräver bara 20 minuter stimulering per dag som analysen av cellens beteende efter en skur av stimulering kan mycket väl vara produktiv.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valfri) </td></tr><tr><td> sulfo-m-maleimidobensoyl-N-hydrosuccinimide ester </td><td> FisherPerbio </td><td> PN22312 </td><td> 25 mM stamlösningar upplösta i vatten kan lagras vid -20 ° C </td></tr><tr><td> 6-brunns vävnadskulturplatta </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td> Plast från andra företag kan belägga dåligt </td></tr><tr><td> 13-mm täckglas </td><td> Vetenskapliga Laboratory Supplies Ltd.SLS </td><td> MIC3336 </td><td> Glas från andra företag kan belägga dåligt </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Ca 2 + Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> 50K-integrin-ligand (fibronektin-fragment) </td><td> Konstruera beskrivning och preparation i 9, 11 </td><td></td><td> Alternativa matris ligander kan användas för att förhöra andra vägar </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3059 </td><td></td></tr><tr><td> Cykloheximid </td><td> Sigma </td><td> C7698 </td><td> Kan lagras som 10mg/ml bestånd i vatten </td></tr><tr><td> DMEM/25 mM HEPES </td><td> Sigma </td><td> D6171 </td><td></td></tr><tr><td> Exogen 4000 + </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultraljud kopplingsgel </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SAFHS indikator </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hVIN-1 </td><td> Sigma </td><td> V9264 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488-konjugerad anti-mus- </td><td> Stratech Scientific </td><td> 715-485-150 </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-märkt falloidin &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P1951 </td><td></td></tr><tr><td> Förlänga Guld antifad reagens </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> komplett proteashämmare (EDTA gratis) </td><td> Roche </td><td> 056 489 001 </td><td> 100 × bestånd består av tabletter förvaras vid -20 ° C </td></tr><tr><td> PAK-glutation-agarospärlor </td><td> Konstruera beskrivning och beredning i 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Fisher </td><td> G/0650/17 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Apollo Scientific </td><td> BI8181 </td><td> Gör 1M lager och pH till 7,4 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher </td><td> S/0160/65 </td><td></td></tr><tr><td> NP40 </td><td> Sigma </td><td> I3021 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium-deoxicholat </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of adhesion-dependent signals using low-intensity ultrasound

I multicellulära organismer, är cellbeteende dikteras av interaktioner med den extracellulära matrisen. Konsekvenserna av matris-ingrepp sträcker sig från regleringen av cell-migration och-proliferation, utsöndring och även differentiering. Signalerna ligger var och en av dessa komplexa processer uppstå från de molekylära interaktioner av extracellulära matrix-receptorer på ytan av cellen. Integriner är den prototypiska receptorer och ger en mekanisk koppling mellan extracellulär matrix och cytoskelettet, såväl som att initiera en del av de adhesionsberoende signalkaskader. Emellertid har det blivit alltmer uppenbart att ytterligare transmembranreceptorer fungera parallellt med de integriner att reglera både den integrin självt och signaler nedströms. Den mest eleganta av dessa exempel är den transmembrana proteoglykan, syndekan-4, som samarbetar med α 5 β 1-integrin under vidhäftning till fibronektin. In vivo-modeller demonstratöreråt vikten av syndekan-4 signalering, som syndekan-4-knockoutmöss uppvisar healing retardation på grund av ineffektiv fibroblast migration 1,2. I vildtyp djur är migration av fibroblaster mot ett sår triggas av förekomsten av fibronektin som läcker från skadade blodkärl och avsattes genom makrofager i skadad vävnad. Därför finns ett stort intresse för att upptäcka strategier som förbättrar fibronektin-beroende signalering och kan påskynda reparationsprocesser. Integrin-medierade och syndekan-4-medierad komponenterna i fibronektin-beroende signalering kan separeras genom att stimulera celler med rekombinanta fibronektinfragment. Även integrin engagemang är avgörande för cell adhesion, vissa fibronektin-beroende signaler regleras av syndekan-4. Syndekan-4 aktiverar RAC1 utskjutande signalen 3, orsakar integrin omfördelning 1, utlösare rekrytering av cytoskelett-molekyler, såsom vinkulin, till fokalsammanväxningar 4, och därmed inducerar riktad migration 3. Vi har sökt alternativa strategier för att aktivera sådana signaler och fann att låg intensitet pulserande ultraljud (LIPUS) kan efterlikna effekterna av syndekan-4 engagemang 5. I detta protokoll beskriver vi den metod med vilken 30 mW / cm 2, 1,5 MHz ultraljud, pulserades vid 1 kHz (fig. 1) kan appliceras på fibroblaster i kultur (fig. 2) för att inducera RAC1 aktivering och fokal adhesion formation. Ultraljud stimulering tillämpas för högst 20 minuter, eftersom denna kombination av parametrar har visat sig vara mest effektiva för acceleration av kliniska frakturer reparation 6. Metoden använder rekombinanta fibronektinfragment att ingripa med α 5 β 1-integrin, utan ingrepp av syndekan-4, och kräver hämning av proteinsyntes genom cykloheximid för att blockera avsättning av ytterligare matris av fibroblasterna., Den positiva effekten of ultraljud reparationsmekanismer är väl dokumenterat 7,8 och genom att förstå den molekylära effekten av ultraljud i kultur vi ska kunna förbättra den terapeutiska tekniken för att förbättra de kliniska resultaten.

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound at JoVE.com

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Detta protokoll beskriver stimulering av odlade fibroblaster med låg intensitet pulserande ultraljud, som driver fokal adhesion bildning och RAC1 aktivering genom att härma ingrepp transmembrana matrisen receptorn, syndekan-4. Detta tillvägagångssätt gör undersökning av en framgångsrik klinisk teknik på cellnivå, vilket ger möjligheter till förbättring av behandlingen.

Induktion av vidhäftning beroende signaler med hjälp av låg intensitet ultraljud

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

Kontrast Ultraljud riktad behandling av gliom hos möss via Drug-Med nanopartiklar Leverans och Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

Introduktion till Ultraljud Riktade mikrobubblor Destruction Teknik

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Wideband optisk detektor av ultraljud för medicinsk bildåtergivning

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

Realtid Övervakning av hög intensitet fokuserat ultraljud (HIFU) ablation av<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine Lever Använda Harmonic Motion Imaging för fokuserat ultraljud (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

Överföring av flera signaler via en optisk fiber Använda Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...

An Experimental Protocol for Assessing the Performance of New Ultrasound Probes Based on CMUT Technology in Application to Brain Imaging

Ett experimentellt protokoll för bedömning av nya ultraljud sonder baserat på CMUT teknik i programmet och hjärnavbildning

The possibility to perform an early and repeatable assessment of imaging performance is fundamental in the design and development process of new ...

Manufacturing Abdominal Aorta Hydrogel Tissue-Mimicking Phantoms for Ultrasound Elastography Validation

Tillverkning av bukaorta Hydrogel vävnad-härma fantomer för ultraljud elastografi validering

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Patient-specifika Polyvinyl Alkohol Phantom Tillverkning med ultraljud och röntgenkontrast för hjärntumör Kirurgi Planering

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Funktionell transkraniell Doppler ultraljud för övervakning cerebralt blodflöde

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation (SHAPE) Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation SHAPE Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

Kontrastförstärkt subharmonisk understödd tryckuppskattning (SHAPE) med ultraljudsavbildning med fokus på att identifiera portalhypertension

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound ...