Name: isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الإنسان الحدود برنامج منح العلوم RGP0024.

1. الحمض النووي تحضير قالب والنسخ في المختبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استنساخ الجينات التي تهم تحت / و T7 أو على سبيل المثال SP6 المروج النسخي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفي المختبر والنسخ الخطي الحمض النووي قالب مع انزيم تقييد الم?...

<ol>
	<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway.">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li><li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli,+Bacillus+subtilis,+Saccharomyces+cerevisiae,+Schizosaccharomyces+pombe,+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens;+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity.">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221 (2006).</li><li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms.">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li><li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA.">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li><li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides,+evidence+for+pause+localization+sites,+and+a+cotranslational+protein-folding+model.">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li><li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation.">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li><li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+translation+of+&#947;+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system:+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding.">Kinetics of translation of &#947; B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li><li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth,+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains.">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li><li>Thanaraj, T. A., Argos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-mediated+translational+pause+and+protein+domain+organization.">Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization.</a> Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).</li><li>Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"silent"+polymorphism+in+the+MDR1+gene+changes+substrate+specificity.">A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity.</a> Science. 315, 525-528 (2007).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa.">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses.">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li></ol>

من أجل تحقيق النتائج استنساخه، ونوعية وتركيز المكونات المستخدمة في النسخ المختبر، وردود الفعل ترجمة حاسمة. في الدراسة الحالية فقد استخدمنا مجموعات المتاحة تجاريا والمقتطفات التي تقدم بيانات استنساخه للغاية، إذا ما تم تناوله بعناية. ومع ذلك، يمكن أن تكون ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف / كيت </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 السامية كيت النسخ العائد </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز المانع </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> عبر [35 S] التسمية </td><td> النائب Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز-A </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12091 </td></tr><tr><td> أرنب نظام المحللة الخلايا الشبكية، وتعامل Nuclease </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> E. القولونية نظام استخراج S30 لقوالب الخطي </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> الطرد المركزي </td><td> بيكمان كولتر </td><td> أوبتيما تلكس منبذة فائقة </td></tr><tr><td> تخزين الفوسفور صورة الإشعاع الذاتيذ </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> اعصار 9410 تصوير الوضع المتغير </td></tr><tr><td> برنامج لتحليل ببتيد الوليدة </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> صورة كوانت TL، v2005 </td></tr></tbody></table>

isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna

معدل استطالة متعدية هي غير موحدة. مرنا هيكل الثانوي، واستخدام كودون ومرنا البروتينات المرتبطة بها قد تغير حركة الريبوسوم على رسالة للمراجعة انظر 1. ومع ذلك، وانه الآن من المتفق عليه على نطاق واسع أن استخدام مرادف كودون هو السبب الرئيسي للمنظمات غير موحدة معدلات استطالة متعدية 1. لا تستخدم الكودونات المترادفة مع تردد متطابقة. والتحيز موجود في استخدام الكودونات المترادفة مع بعض الكودونات المستخدمة بشكل متكرر أكثر من غيرها 2. كودون التحيز هو كائن حي، وكذلك الأنسجة محددة 2،3. وعلاوة على ذلك، وتواتر استخدام كودون يتناسب طرديا مع تركيزات tRNAs وما شابه ذلك 4. وبالتالي، فإن كودون المستخدمة بشكل متكرر وارتفاع عدد وافر من tRNAs المقابلة، وهو ما يعني كذلك أن ترجم كودون متكررة بشكل أسرع من واحد نادر. وبالتالي، سيكون مرنا في المناطق ثراء في كودونات نادر (مواقع وقفة المحتملة) كقاعدة تبطئ حركة الريبوسوم في المساءجنرال الكتريك وسبب تراكم الببتيد الوليدة من أحجام كل منها 5-8. هذه المواقع يمكن أن يكون لها تأثير وقفة وظيفي على تعبير البروتين، واستقرار مرنا وقابلة للطي البروتين للمراجعة انظر 9. في الواقع، تبين أن التخفيف من هذه المواقع وقفة يمكن أن يغير حركة الريبوسوم على مرنا، وبعد ذلك قد يؤثر على كفاءة المشارك متعدية طي البروتين (في الحي) 1،7،10،11. لفهم عملية طي البروتين في الجسم الحي، في الخلية، ويقترن ذلك في نهاية المطاف إلى عملية تخليق البروتين من الضروري أن تحصل على معلومات شاملة عن تأثير استخدام محتوى / الحمض الريبي النووي النقال كودون على حركة ريبوسوم على طول مرنا أثناء استطالة متعدية . نحن هنا وصف تقنية بسيطة والتي يمكن استخدامها لتحديد المواقع الرئيسية وقفة ترجمة لمرنا نظرا تترجم في نظم خالية من الخلايا المختلفة 6-8. ويستند هذا الإجراء على العزلة من accumulati البروتينية الوليدةنانوغرام في ريبوسوم خلال الترجمة في المختبر لمرنا الهدف. الأساس المنطقي هو أن في التردد المنخفض كودونات، الزيادة في وقت الإقامة للنتائج ريبوسوم في زيادة كميات الببتيدات الوليدة من أحجام المقابلة. في المختبر مرنا المحولة يستخدم لردود الفعل في المختبر متعدية في وجود الأحماض الأمينية المسمى بالإشعاع للسماح للكشف عن السلاسل الوليدة. من أجل عزل متجهة الوليدة الريبوسوم المجمعات ببتيد والطبقات رد فعل الترجمة على رأس حل الجلسرين بنسبة 30٪ تليها الطرد المركزي. يتم التعامل مع مزيد من البروتينية الوليدة في بيليه polysomal مع ريبونوكلياز ألف وحلها بواسطة SDS PAGE. ويمكن هذه التقنية المستخدمة المحتمل لأي بروتين ويسمح تحليل حركة الريبوسوم على طول مرنا والكشف عن مواقع وقفة كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة العوامل والظروف التي يمكن أن تغير حركة الريبوسوم، وبالتالي يحتمل أن يغير أيضا عشره وظيفة / التشكل من البروتين.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA at JoVE.com

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

وصفت وهناك تقنية لتحديد المواقع وقفة متعدية على مرنا. ويستند هذا الإجراء على عزل البروتينية وليدة تراكم على ريبوسوم في المختبر خلال ترجمة لمرنا هدف، يليه تحليل حجم السلاسل الوليدة باستخدام هلام إستشراد يبدل طبيعة المكونات.

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR كليب -- وسيلة لتحديد نطاق Transcriptome مواقع الربط من البروتينات الحمض النووي الريبي تجليد

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

في المختبر، والسد النسخ من مرنا luciferase المراسل Gaussia تلاه ترنسفكأيشن الخلية هيلا

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

في المختبر توليف التعديل مرنا للتحريض التعبير البروتين في الخلايا البشرية

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

قياس مقاومة الاكسدة من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في 96-جيدا لوحات عيار مكروي

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

فحص البروتينات ملزمة لالوليدة DNA في خلايا الثدييات عن طريق BrdU رقاقة فتحة للغرب تقنية

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

تعيين بروتوكول لاستخدام الجينات إثراء التحليل لتحديد نموذج الحيوان المناسب للبحوث متعدية

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

في المختبر تحليل سومويليشن لدراسة النشاط ليجاسى E3 السومو

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

تثبيت سريع في Vivo وعزل المجمعات الترجمية من الخلايا Eukaryotic

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...