Name: isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door Human Frontier Science Program subsidie ​​RGP0024.

1. DNA Template Voorbereiding en in vitro transcriptie <ol><li> Het gen van belang wordt gekloneerd onder T7 en / of bijvoorbeeld SP6 transcriptionele promoter. </li><li> Voor in vitro transcriptie het template-DNA wordt gelineariseerd met een geschikte restrictie-enzym snijden achter het stopcodon ORF en / of mRNA 3 &#39;uiteinde. Men moet volledig linearisatie van het plasmide DNA te controleren door uitvoering van de restrictiedigestie product agarosegelelektroforese. </li><li> De gelineariseerde ...

<ol>
	<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway.">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li><li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli,+Bacillus+subtilis,+Saccharomyces+cerevisiae,+Schizosaccharomyces+pombe,+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens;+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity.">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221 (2006).</li><li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms.">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li><li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA.">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li><li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides,+evidence+for+pause+localization+sites,+and+a+cotranslational+protein-folding+model.">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li><li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation.">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li><li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+translation+of+&#947;+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system:+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding.">Kinetics of translation of &#947; B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li><li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth,+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains.">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li><li>Thanaraj, T. A., Argos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-mediated+translational+pause+and+protein+domain+organization.">Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization.</a> Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).</li><li>Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"silent"+polymorphism+in+the+MDR1+gene+changes+substrate+specificity.">A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity.</a> Science. 315, 525-528 (2007).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa.">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses.">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li></ol>

Voor reproduceerbare resultaten kwaliteit en de concentratie van de componenten die in vitro transcriptie en translatie reacties kritisch zijn. In de huidige studie hebben we gebruik hebben gemaakt van commercieel verkrijgbare kits en extracten die zeer reproduceerbare gegevens te verstrekken, indien zorgvuldig behandeld. Echter, vertaling-competent extracten worden bereid uit de cel van een keuze, indien nodig. Kwaliteit van mRNA kan invloed hebben op de vertaling, dus het is van het grootste belang om de inte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens / Kit </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 High yield transcriptiekit </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> Ribonucleaseremmer </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Trans [35 S]-Label </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Ribonuclease-A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091 </td></tr><tr><td> Konijn reticulocytentelling Lysate System, Nuclease behandeld </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> E. coli S30 Extract System voor lineaire Templates </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> Centrifugeren </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima TLX Ultracentrifuge </td></tr><tr><td> Opslag fosfor autoradiogramy </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 variabele modus imager </td></tr><tr><td> Software voor ontluikende polypeptide-analyse </td><td> GE Healthcare </td><td> Image Quant TL, v2005 </td></tr></tbody></table>

isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna

De snelheid van translationeel rek is niet uniform. mRNA secundaire structuur, codongebruik en mRNA bijbehorende eiwitten kunnen ribosoom beweging te wijzigen op het bericht voor review zie 1. Echter, het is nu algemeen aanvaard dat synoniem codon-gebruik is de belangrijkste oorzaak van niet-uniforme translationeel rek tarieven 1. Synoniem codons worden niet gebruikt met dezelfde frequentie. Een voorkeur bestaat in het gebruik van synoniem codons enkele codons vaker gebruikt dan andere twee. Codon bias is organisme en weefsel-specifieke 2,3. Bovendien frequentie codongebruik is recht evenredig met de concentratie van verwante tRNA 4. Zo zal een veel gebruikte codon hogere massa overeenkomstige tRNA, die verder betekent dat vaak codon harder dan een zeldzame een vertaald. Zo zal de regio&#39;s op mRNA verrijkt met zeldzame codons (potentiële pauze sites) te vertragen in de regel naar beneden ribosoom beweging op de Message en de oorzaak accumulatie van ontluikende peptiden van de respectievelijke maten 5-8. Deze pauze sites kunnen functionele impact hebben op de eiwitexpressie hebben, mRNA stabiliteit en het vouwen van eiwitten voor review zie 9. Er werd aangetoond dat het verlichten van deze pauze sites ribosoom beweging te wijzigen op mRNA en vervolgens kan de efficiëntie van co-translationele (in vivo) eiwitvouwing 1,7,10,11 beïnvloeden. Om het proces van eiwitvouwing in vivo begrijpen in de cel, die uiteindelijk is gekoppeld met de werkwijze van de eiwitsynthese is het noodzakelijk volledig inzicht in het effect van codongebruik / tRNA inhoud van de beweging van ribosomen langs mRNA tijdens translatie elongatie . Beschrijven we een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt om grote vertaling onderbreken plaatsen voor een bepaalde mRNA vertaald in verschillende celvrije systemen 6-8 vinden. Deze procedure is gebaseerd op de isolatie van ontluikende Polypeptiden accumulating van ribosomen tijdens in vitro translatie van een doel-mRNA. De reden is dat bij lage frequenties codons, de toename van de verblijftijd van de ribosomen resultaten in grotere hoeveelheden beginnende peptiden van de overeenkomstige afmetingen. In vitro getranscribeerde mRNA gebruikt voor in vitro translatie reacties in aanwezigheid van radioactief gemerkt aminozuren de detectie van de beginnende ketens mogelijk. Om ribosoom gebonden beginnende polypeptide complexen isoleren vertaling reactie lagen op 30% glycerol oplossing gevolgd door centrifugatie. Nascent Polypeptiden in polysomal pellet verder behandeld wordt met ribonuclease A en opgelost door SDS-PAGE. Deze techniek kan eventueel worden gebruikt voor een eiwit en laat analyse van ribosoom beweging langs mRNA en de detectie van de grote pauze sites. Bovendien kan dit protocol worden aangepast aan factoren en omstandigheden die ribosoom beweging kan dus veranderen en mogelijk kan ook veranderen e bestuderene functie / conformatie van het eiwit.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA at JoVE.com

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Een techniek om translationeel pauze sites op mRNA te identificeren wordt beschreven. Deze procedure is gebaseerd op isolatie van beginnende Polypeptiden ophopen op ribosomen tijdens in vitro translatie van een doel-mRNA, gevolgd door de grootte analyse van de ontluikende ketens met een denaturerende gelelektroforese.

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - een methode om Transcriptome-breed de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcriptie en aftopping van Gaussia Luciferase mRNA Gevolgd door HeLa celtransfectie

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro Synthese van gemodificeerde mRNA voor inductie van eiwitexpressie in menselijke cellen

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Het meten van oxidatieve stress Weerstand van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-well microtiterplaten

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Onderzoek van eiwitten gebonden aan ontluikende DNA in zoogdiercellen met behulp van BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Meten van de stijfheid van<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorta&#39;s met behulp van Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Een Protocol voor het gebruik van Gene ingesteld verrijking analyse om te identificeren van de juiste diermodel voor translationeel onderzoek

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay te studeren SUMO E3 Ligase activiteit

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...