Name: isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00
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Ce travail a été financé par Human Frontier Science Program de subvention RGP0024.

1. Préparation Patron de l&#39;ADN et la transcription in vitro <ol><li> Le gène d&#39;intérêt est cloné dans T7 et / ou, par exemple SP6 promoteur transcriptionnel. </li><li> Pour la transcription in vitro de la matrice d&#39;ADN est linéarisé par une enzyme de restriction appropriée de coupe en aval du codon stop ORF et / ou de l&#39;ARNm extrémité 3 &#39;. Il faut vérifier linéarisation complète de l&#39;ADN plasmidique en exécutant le produit de digestion de restri...

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	<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway.">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li><li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli,+Bacillus+subtilis,+Saccharomyces+cerevisiae,+Schizosaccharomyces+pombe,+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens;+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity.">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221 (2006).</li><li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms.">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li><li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA.">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li><li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides,+evidence+for+pause+localization+sites,+and+a+cotranslational+protein-folding+model.">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li><li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation.">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li><li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+translation+of+&#947;+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system:+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding.">Kinetics of translation of &#947; B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li><li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth,+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains.">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li><li>Thanaraj, T. 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Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses.">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li></ol>

Pour obtenir des résultats reproductibles, la qualité et la concentration des composants utilisés pour la transcription in vitro et les réactions de traduction sont essentielles. Dans l&#39;étude actuelle, nous avons utilisé des kits disponibles dans le commerce et les extraits qui fournissent des données hautement reproductibles, s&#39;il est manipulé avec soin. Cependant, la traduction-compétentes extraits peuvent être préparés à partir de la cellule de son choix, si nécessaire. Qualit?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Kit </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 haute Kit de transcription rendement </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la ribonucléase </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Trans [35 S]-Label </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Ribonucléase-A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091 </td></tr><tr><td> De réticulocytes de lapin Lysate système, nucléase traité </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> E. coli S30 Extrait système pour les modèles linéaires </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> Centrifugation </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima TLX Ultracentrifugeuse </td></tr><tr><td> Luminophore de mémorisation autoradiographiey </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 imageur mode variable </td></tr><tr><td> Logiciel pour l&#39;analyse du polypeptide naissant </td><td> GE Healthcare </td><td> Quant image TL, v2005 </td></tr></tbody></table>

isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna

Le taux d&#39;allongement de translation n&#39;est pas uniforme. ARNm structure secondaire, l&#39;usage des codons et ARNm des protéines associées peuvent modifier le mouvement du ribosome sur le message pour revue, voir 1. Cependant, il est maintenant largement admis que l&#39;usage des codons synonymes est la principale cause de non-uniformes des taux d&#39;allongement de translation 1. Codons synonymes ne sont pas utilisés avec une fréquence identique. Un biais existe dans l&#39;utilisation des codons synonymes avec certains codons utilisés plus fréquemment que d&#39;autres 2. Codon biais est l&#39;organisme ainsi que le tissu spécifique 2,3. En outre, la fréquence de l&#39;usage des codons est directement proportionnelle à la concentration des ARNt apparenté 4. Ainsi, un codon fréquemment utilisé aura plus multitude de ARNt correspondants, ce qui implique en outre que d&#39;un codon fréquentes seront traduits plus rapidement qu&#39;une rares. Ainsi, les régions sur l&#39;ARNm enrichi en codons rares (sites de pause potentiels) seront, en règle ralentir le mouvement du ribosome sur le message d&#39;accumulation et de la cause des peptides naissants des tailles respectives 5-8. Ces sites de pause peut avoir un impact fonctionnel sur l&#39;expression des protéines, stabilité de l&#39;ARNm et le repliement des protéines pour revue, voir 9. En effet, il a été montré que l&#39;atténuation de ces sites de pause peut altérer le mouvement du ribosome sur l&#39;ARNm et par la suite peut affecter l&#39;efficacité du co-traductionnelle repliement des protéines (in vivo) 1,7,10,11. Pour comprendre le processus de repliement des protéines in vivo, dans la cellule, qui est finalement couplé au processus de synthèse des protéines, il est essentiel d&#39;obtenir un aperçu complet sur ​​l&#39;impact du codon d&#39;utilisation / ARNt contenu sur le mouvement des ribosomes le long de l&#39;ARNm en cours d&#39;élongation translationnelle . Nous décrivons ici une technique simple qui peut être utilisé pour localiser les principaux sites de pause de traduction pour un ARNm donné traduit en diverses des systèmes acellulaires 6-8. Cette procédure est basée sur l&#39;isolement des polypeptides naissante accumulating sur les ribosomes lors de la traduction in vitro d&#39;un ARNm cible. La logique est celle à basse fréquence des codons, l&#39;augmentation du temps de séjour des résultats ribosomes dans des quantités accrues de peptides naissants des tailles correspondantes. Dans ARNm transcrit in vitro est utilisé pour des réactions de translation in vitro de la présence d&#39;acides aminés marqués radioactivement pour permettre la détection des chaînes naissantes. Afin d&#39;isoler les ribosomes liés naissantes complexes polypeptidiques la réaction de traduction est posée sur le dessus de la solution de glycérol à 30% suivie d&#39;une centrifugation. Polypeptides naissants dans polysomique granulés sont traités avec la ribonucléase A et résolus par SDS-PAGE. Cette technique peut être éventuellement utilisées pour une protéine et permet l&#39;analyse de mouvement le long du ribosome ARNm et la détection des sites de pause principaux. En outre, ce protocole peut être adapté pour étudier les facteurs et conditions qui peuvent altérer le mouvement du ribosome et donc potentiellement peut également modifier ee fonction / conformation de la protéine.

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Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Une technique pour identifier les sites de pause translationnelle sur l&#39;ARNm est décrite. Cette procédure est basée sur l&#39;isolement des polypeptides naissants qui s&#39;accumulent sur les ribosomes lors de la traduction in vitro d&#39;un ARNm cible, suivie par l&#39;analyse de la taille des chaînes naissantes en utilisant une électrophorèse sur gel dénaturant.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

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