Name: isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00
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Diese Arbeit wurde vom Human Frontier Science Program RGP0024 Zuschuss finanziert.

1. DNA-Schablone Herstellung und in vitro Transkription <ol><li> Das Gen von Interesse unter T7 und / oder zB SP6-Transkriptions-Promotor kloniert. </li><li> Für in-vitro-Transkription der Matrizen-DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym-Schnittstellen stromabwärts des Stop-Codon ORF und / oder mRNA 3&#39;-Ende linearisiert. Man braucht, um eine vollständige Linearisierung der Plasmid-DNA durch Ausführen des Restriktionsverdau Produkt auf Agarose-Gelelektrophorese überprüft. </li><li> Das li...

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	<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway.">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li><li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. 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A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation.">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li><li>Komar, A. 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Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses.">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li></ol>

Für reproduzierbare Ergebnisse, Qualität und Konzentration der Komponenten für die in vitro Transkription und Translation-Reaktionen verwendet kritisch sind. In der aktuellen Studie haben wir kommerziell verfügbaren Kits und Extrakte, die in hohem Maße reproduzierbar Daten zu liefern, bei sorgfältiger Behandlung eingesetzt. Jedoch kann die Übersetzung-zuständigen Extrakte aus der Zelle des eigenen Wahl hergestellt werden, wenn nötig. Qualität der mRNA kann die Translation beeinflussen, so ist es von g...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Kit </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> Ribonuclease Inhibitor </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Trans [35 S]-Label </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Ribonuclease-A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091 </td></tr><tr><td> Kaninchen-Retikulozytenlysat-System behandelt, Nuclease </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> E. coli S30-Extrakt-System für lineare Matrizen </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> Zentrifugation </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima TLX Ultrazentrifuge </td></tr><tr><td> Speicherleuchtstoffplatte Autoradiogrammy </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 Variable Mode Imager </td></tr><tr><td> Software zur Analyse entstehenden Polypeptid </td><td> GE Healthcare </td><td> Bild Quant TL, V2005 </td></tr></tbody></table>

isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna

Die Geschwindigkeit der Translationselongation ungleichmäßig ist. Sekundärstruktur der mRNA, mRNA-Codon-Nutzung und assoziierten Proteinen kann Ribosom Bewegung auf die Meldung zur Prüfung zu verändern siehe 1. Allerdings ist es nun weitgehend akzeptiert, dass ein Synonym Codonverwendung die primäre Ursache für ungleichmäßige Translationselongation Sätze 1 ist. Synonyme Codons sind nicht mit gleicher Frequenz verwendet. Eine Vorspannung besteht in der Verwendung von synonymen Codons mit Codons einigen häufiger als andere 2 verwendet. Codon-Bias ist Organismus als auch gewebespezifische 2,3. Darüber hinaus ist die Frequenz der Codonverwendung direkt proportional zu den Konzentrationen von verwandten tRNAs 4. Somit wird ein häufigsten verwendeten Codons höhere Vielzahl von entsprechenden tRNAs, die impliziert, dass ein häufiges Codon schneller als einem seltenen wird man übersetzt werden. So werden die Regionen auf mRNA in seltenen Codons (potentiellen Pause Sites) angereichert in der Regel langsamer Bewegung auf dem Ribosom MessaGE und Ursache entstehende Anhäufung von Peptiden der jeweiligen Größen 5-8. Diese Pause Standorte können funktionelle Auswirkungen auf die Protein-Expression haben, finden die mRNA-Stabilität und Faltung von Proteinen für die Überprüfung 9. Tatsächlich wurde gezeigt, dass eine Senkung der solche Pause-Seiten können Ribosom Bewegung auf mRNA verändern und anschließend kann die Effizienz der Co-translationale (in vivo) Proteinfaltung 1,7,10,11 beeinflussen. Um den Prozess der Proteinfaltung in vivo zu verstehen, in der Zelle, die letztlich auf den Prozess der Protein-Synthese ist es wichtig, umfassende Einblicke in die Auswirkungen der Codon-Nutzung / tRNA-Inhalte auf die Bewegung entlang der Ribosomen-mRNA gewinnen während Translationselongation gekoppelt . Hier beschreiben wir eine einfache Technik, die zur großen Pause Übersetzung Standorte für eine bestimmte mRNA in verschiedenen zellfreien Systemen 6-8 übersetzt zu lokalisieren. Dieses Verfahren beruht auf der Trennung entstehenden Polypeptide accumulati Basisng an Ribosomen während der in vitro Translation eines Target-mRNA. Der Grund ist, dass bei niedrigen Frequenzen Codons, die Erhöhung der Verweilzeit der Ribosomen führt zu einer erhöhten Mengen von naszierendem Peptide der entsprechenden Größe. In-vitro-transkribierte mRNA wurde in vitro Translations-Reaktionen in Gegenwart von radioaktiv markierten Aminosäuren die Detektion der naszierenden Ketten zu ermöglichen. Um Ribosom gebundenen Komplexe entstehenden Polypeptid zu isolieren die Übersetzung Reaktion auf von 30% Glycerin-Lösung geschichtet, gefolgt von Zentrifugation. Nascent Polypeptide in polysomaler Pellets werden weiter mit Ribonuklease A behandelt und durch SDS-PAGE. Diese Technik kann für jedes Protein potentiell verwendet werden und ermöglicht die Analyse der Bewegung entlang Ribosom-mRNA und der Nachweis der größten Pause Seiten. Zusätzlich kann dieses Protokoll angepasst, um Faktoren und Bedingungen, die Ribosomen-Bewegung zu verändern und damit potentiell auch verändern th studieren werdene-Funktion / Konformation des Proteins.

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Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Eine Technik zur translationalen Pause Sites auf mRNA zu identifizieren beschrieben wird. Dieses Verfahren beruht auf der Trennung entstehenden Polypeptide ansammeln auf Ribosomen während der in vitro Translation einer Ziel-mRNA, durch die Größe Analyse der naszierenden Ketten mit Hilfe eines denaturierenden Gelelektrophorese gefolgt basiert.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Forschung

Biologie

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

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In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

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In vitro Synthese von modifizierten mRNA zur Induktion der Proteinexpression in menschlichen Zellen

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

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Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

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Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

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Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

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