Name: isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי תוכנית מדע האדם Frontier מענק RGP0024.

1. תבנית ה-DNA הכנה בתעתיק חוץ גופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגן של הריבית מתחת T7 לשכפל ו / או למשל SP6 האמרגן תעתיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכן שעתוק במבחנה DNA התבנית לינארית עם אנזים הגבלה מתאים לחיתוך במורד הזרם של קודון עצירה...

<ol>
	<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway.">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li><li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli,+Bacillus+subtilis,+Saccharomyces+cerevisiae,+Schizosaccharomyces+pombe,+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens;+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity.">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221 (2006).</li><li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms.">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li><li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA.">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li><li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides,+evidence+for+pause+localization+sites,+and+a+cotranslational+protein-folding+model.">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li><li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation.">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li><li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+translation+of+&#947;+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system:+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding.">Kinetics of translation of &#947; B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li><li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth,+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains.">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li><li>Thanaraj, T. A., Argos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-mediated+translational+pause+and+protein+domain+organization.">Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization.</a> Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).</li><li>Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"silent"+polymorphism+in+the+MDR1+gene+changes+substrate+specificity.">A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity.</a> Science. 315, 525-528 (2007).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa.">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses.">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li></ol>

לקבלת תוצאות לשחזור, איכות ריכוז המרכיבים המשמשים ב שעתוק במבחנה תרגום התגובות הן קריטיות. במחקר הנוכחי השתמשנו ערכות זמינים מסחרית ותמציות המספקים נתונים לשחזור ביותר, אם מטופל בזהירות. עם זאת, תרגום, המוסמכות תמציות ניתן להכין מתא הבחירה של האדם, במידת הצ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / Kit </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 ערכת גבוהה תמלול תשואה </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> Ribonuclease אינהיביטור </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> חוצה [35 S]-Label </td><td> מגה פיקסל Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Ribonuclease- </td><td> Invitrogen </td><td> 12091 </td></tr><tr><td> הארנב מערכת Reticulocyte lysate, התייחס nuclease </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> E. coli S30 תמצית מערכת תבניות לינאריות </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> צנטריפוגה </td><td> Beckman Coulter </td><td> אופטימה ultracentrifuge TLX </td></tr><tr><td> אחסון זרחן autoradiography </td><td> GE Healthcare </td><td> טייפון 9410 במצב משתנה imager </td></tr><tr><td> תוכנה לניתוח פוליפפטיד המתהווה </td><td> GE Healthcare </td><td> תמונה קוואנט TL, v2005 </td></tr></tbody></table>

isolation of ribosome bound nascent polypeptides in vitro to identify translational pause sites along mrna

קצב התארכות translational היא לא אחידה. mRNA מבנה משני, שימוש קודון ו-mRNA חלבונים הקשורים סילוף תנועת הריבוזום על הודעה של חוות דעת ראה 1. עם זאת, זה עתה מקובל כי השימוש קודון נרדף הוא הגורם העיקרי שאינם אחידים שיעורי התארכות של תרגום 1. קודונים נרדפים לא משמשים בתדירות זהה. ההטיה קיימת בשימוש קודונים נרדף כמה קודונים בשימוש בתדירות גבוהה יותר מאחרים 2. קודון ההטיה היא אורגניזם כמו גם רקמה ספציפית 2,3. יתר על כן, תדירות השימוש קודון עומד ביחס ישר ריכוזי tRNAs מאותו מקור 4. לפיכך, קודון שימוש תכוף יהיה רב יותר של tRNAs המתאימים, אשר נוסף מצביע על כך קודון תכופים יתורגם מהר יותר מאשר 1 נדירים. כך, אזורים על mRNA המועשר קודונים נדירים (אתרי להשהות פוטנציאליים) יהיה בדרך כלל להאט את תנועת הריבוזום על מסהGE ולגרום הצטברות של פפטידים המתהווה של גדלים בהתאמה 5-8. אתרים אלה יכולים להשהות השפעה תפקודית על ביטוי החלבון, יציבות ה-mRNA ו קיפול חלבונים לבדיקה לראות 9. אכן, הוכח כי הקלה של אתרי להשהות כאלה יכולים לשנות את תנועת הריבוזום על ה-mRNA, ובהמשך עשוי להשפיע על היעילות של קיפול (in vivo) שיתוף translational חלבון 1,7,10,11. כדי להבין את התהליך של קיפול חלבונים in vivo, בתא, כי הוא יחד בסופו של דבר לתהליך של סינתזה של חלבון זה חיוני כדי לקבל תובנות מקיפות אל ההשפעה של השימוש בתוכן / tRNA קודון על תנועת ריבוזומים לאורך ה-mRNA במהלך התארכות translational . כאן אנו מתארים טכניקה פשוטה, שניתן להשתמש בהם כדי לאתר הגדולות להשהות תרגום אתרי ה-mRNA ניתן לתרגם בתא ללא מערכות שונות 6-8. הליך זה מבוסס על בידוד של המתהווה פוליפפטידים accumulating על הריבוזומים במהלך בתרגום חוץ גופית של mRNA המטרה. הרציונל הוא כי בתדירות נמוכה קודונים, עלייה בזמן מגוריו של תוצאות ריבוזומים בכמות מוגברת של פפטידים המתהווה של בגדלים המתאימים. ב-mRNA חוץ גופית עיבד משמש במבחנה תגובות של תרגום בנוכחות חומצות אמינו שכותרתו רדיואקטיבית כדי לאפשר זיהוי של רשתות המתהווה. כדי לבודד את הריבוזום מתחמי קשורות פוליפפטיד המתהווה התגובה התרגום שכבות על גבי פתרון גליצרול 30% ואחריו צנטריפוגה. פוליפפטידים המתהווה ב polysomal גלולה מטופלים נוספים עם ribonuclease והחליט על ידי SDS. טכניקה זו יכולה לשמש פוטנציאל של חלבון כל ומאפשר ניתוח של תנועת הריבוזום לאורך ה-mRNA לבין זיהוי האתרים להשהות הגדולות. בנוסף, פרוטוקול זה ניתן להתאים ללמוד גורמים ותנאים שיכולים לשנות תנועת הריבוזום ובכך באופן פוטנציאלי יכול גם לשנות את הדואר פונקציה / קונפורמציה של החלבון.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA at JoVE.com

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

טכניקה לזהות אתרים על הפסקה של תרגום ה-mRNA מתואר. הליך זה מבוסס על בידוד של פוליפפטידים המתהווה המצטברים על הריבוזומים במהלך בתרגום חוץ גופית של mRNA המטרה, ואחריו ניתוח בגודל של רשתות המתהווה באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה denaturing.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

במבחנת הסינתזה של mRNA השתנה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים אנושיים

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

מדידת התנגדות סטרס חמצוני של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; בצלחות microtiter 96-היטב

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

פרוטוקול להצפנה באמצעות גנים להגדיר העשרה ניתוח כדי לזהות את המודל החייתי המתאים עבור המחקר Translational

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

במבחנה SUMOylation Assay ללמוד סומו E3 ליגאז פעילות

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...